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布鲁氏菌病是一种人畜共患疾病,对畜牧业和人类健康构成了巨大威胁,被列为B类传染病。目前还没有人用布病疫苗,主要是通过布鲁氏菌弱毒活疫苗接种动物来防控布病。目前大多数动物布病疫苗为光滑型的减毒活疫苗,毒副作用较大、无法区分自然感染和人工免疫等不足。布鲁氏菌的致病机制还不完全清楚。脂多糖(LPS)是布氏杆菌非常重要的毒力因子,具有较强的抗原性。根据现有的研究表明,LPS的完整性与其胞内存活、增殖和毒力等密切相关。gmd、per和manb都与光滑型布鲁氏菌的LPS的生物合成过程有关。这些基因的缺失可以导致光滑型布鲁氏菌变为粗糙型布鲁氏菌。目的:本研究通过同源重组缺失了羊种布鲁氏菌生物3型流行株015的gmd,per和manb基因,构建相应的粗糙型缺失株;并在小鼠巨噬细胞RAW264.7和昆明系小鼠体内初步评价其毒力致弱情况,检测了免疫小鼠血清中IgG和IFN-γ水平;同时分别表达了gmd,per和manb蛋白,Western blot验证其反应原性;旨在为研发能区分疫苗免疫和自然感染的羊种布鲁氏菌标记性疫苗提供基础材料。方法:本研究以羊种布鲁氏菌015为模板,分别克隆gmd,per和manb基因的上、下游同源臂,以枯草芽孢杆菌为模板克隆SacB基因,将克隆得到的序列连接到pMDS19-T载体上,采用双酶切法将上游同源臂、下游同源臂、SacB序列分别连到自杀载体pGEM-7Zf上,分别构建了同源重组自杀载体pGEM-7Zf-Δgmd-SacB(pgs),pGEM-7Zf-Δper SacB(pps)和pGEM-7Zf-Δmanb-SacB(pms),然后分别电转至羊种布鲁氏菌015感受态细胞中,通过多次筛选分别获得015Δgmd,015Δper和015Δmanb基因缺失株;对获得的缺失株进行PCR鉴定和遗传稳定性等检测。用稳定遗传的粗糙型缺失株分别侵染鼠源巨噬细胞RAW264.7和昆明系小鼠,通过载菌量(CFU)检测缺失株毒力致弱情况;通过间接ELISA方法检测了免疫小鼠血清中IgG和IFN-γ水平。此外,用PCR方法分别扩增gmd,per和manb基因,将测序正确的基因序列分别克隆到大肠杆菌表达载体pET-28a上,然后转化至大肠杆菌DE3(BL21)中诱导表达。建立稳定的表达gmd,per和manb蛋白的体系,用布鲁氏菌自然感染绵羊血清进行western blot检测,最终筛选出有鉴别诊断意义的抗原蛋白。结果:成功构建了遗传稳定的粗糙型羊种布鲁氏菌015Δgmd,015Δper,015Δmanb缺失株,在20代内没有发生回复突变;015Δgmd,015Δper和015Δmanb缺失株在细胞水平和小鼠体体内证实毒力都显著降低且具有较好的免疫原性;以布鲁氏菌自然感染羊血清证实gmd、manb和per蛋白反应原性良好,具有自然感染与候选疫苗免疫抗体区分的潜在价值。结论:构建的羊种布鲁氏菌015Δgmd、015Δper和015Δper缺失株与对应表达蛋白联合应用,有望研发具有自主知识产权的缺失候选疫苗及配套诊断方法。