日本血吸虫病是一种具有寄生性、地方性、自然疫源性、严重危害人类健康的人兽共患型寄生虫病。宿主接触到含有尾蚴的疫水后,尾蚴可钻皮进入宿主体内并转化为童虫,童虫在体内进一步发育,待性器官成熟后雌雄合抱,移行至门脉-肠系膜静脉系统定居并交配产卵,虫卵主要沉积在肠壁组织和肝脏组织内。沉着于组织内的虫卵的卵细胞约经11天即发育成毛蚴。由于成熟虫卵内毛蚴的分泌物可透过卵壳,引起虫卵周围组织和血管壁发生炎症坏死继而形成虫卵肉芽肿和肝纤维化,因此,虫卵是导致慢性血吸虫病甚至发展为晚期血吸虫病的主要致病因素。血吸虫与宿主相互作用,采用分子/抗原伪装、模拟,合成神经性分子和抑制宿主免疫效应的物质等方式参与免疫逃避,同时血吸虫体表还分布着某些能和宿主分子相结合的受体,利用宿主免疫反应所提供的某些效应分子如转化生长因子β1(transforming growth factorβ1,TGF-β1),促进自身的发育、成熟和生殖。在多种细胞因子中,TGF-β1是目前公认的最强的肝纤维化促进因子之一。肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)的激活是肝纤维化发生的中心环节,脂质过氧化物的活化可促使HSC释放大量TGF-β1,TGF-β1反过来又引起HSC的活化和细胞外基质(extracellular matrixc,ECM)的产生,另外,TGF-β1还可促使窦状内皮细胞对纤溶酶原激活因子抑制剂合成增多、抑制HSC合成胶原蛋白酶、促使HSC表达基质金属蛋白酶抑制剂(TIMP)等抑制ECM的正常降解。大量间质胶原和其他ECM成分,首先沉积于Disse间隙,最终导致肝纤维化。TGF-β1亦是一种免疫抑制因子,可对细胞免疫、体液免疫和非特异性免疫中起着免疫抑制作用。TGF-β超家族由一类结构和功能都相似的多肽生长因子亚家族组成,其中TGF-β亚家族是成员之一,包括TGF-β1～6,在哺乳动物中表达并已克隆的有TGF-β1～3,种属间具有高度的同源性。TGF-β1可以以有活性或无活性的形式存在于机体中,活化后的TGF-β1与细胞膜上的特异受体结合通过Smad信号转导途径发挥生物学作用。由于它在各物种间高度保守,故推测在日本血吸虫中亦可能存在TGF-β1基因,在日本血吸虫病性肝纤维化的形成方面起着一定的作用。研究目的:在本课题组已克隆、表达的SjTGF-β1成熟肽的基础上,通过RACE方法获得SjTGF-β1基因cDNA序列。利用生物学信息技术对所获得的序列进行理论分析和功能预测;原核克隆、表达SjTGF-β1部分cDNA序列,并对表达的蛋白行免疫反应性分析;对该基因在虫体生长的各个时期的转录水平、表达水平进行检测,以初步确定在日本血吸虫中是否存在TGF-β1基因;同时检测在日本血吸虫感染小鼠不同时期肝脏的TGF-β1表达水平,以及在不同感染阶段小鼠血浆中的TGF-β1,初步探讨虫源性和宿主源性的TGF-β1在日本血吸虫致宿主肝纤维化过程中的作用。研究方法:(1)SjTGF-β1成熟肽序列已由本课题组朱郇悯硕士扩增完成,SjTGF-β1基因序列由上海英骏生物技术(Invitrogen)有限公司通过RACE方法扩增获得。利用GeneBank,ExPASy等对该基因序列进行生物学信息分析,设计特异性引物,将成虫总RNA进行RT-PCR以扩增获得SjTGF-β1基因片段,采用TA克隆的方法并将该片段亚克隆至原核表达载体pET28a(+),构建pET28a(+)-SjTGF-β1重组质粒,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)以建立pET28a(+)-SjTGF-β1重组工程菌株。利用PCR、酶切和测序方法对重组质粒鉴定,经IPTG诱导重组蛋白表达,获得重组工程菌株高效表达的目的蛋白,并对该蛋白进行免疫反应性检测。(2)采用荧光定量PCR技术,利用特异性引物分析SjTGF-β1基因在尾蚴、虫卵、雌、雄成虫和Sj感染小鼠各个时期肝脏中的转录水平;(3)利用Western Blot技术检测Sj雌、雄成虫中是否表达TGF-β1蛋白,以及Sj感染各期小鼠肝脏中SjTGF-β1和小鼠TGF-β1的表达水平。(4)利用酶联免疫吸附实验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)和免疫组织化学染色实验分析Sj感染小鼠体内总TGF-β1的表达水平。研究结果:(1)将获得的SjTGF-β1核苷酸序列在NCBI网站上进行比对(Blastn)和分析,发现其中777bp大小的片段与小鼠及人的同一性(identity)分别为85%、89% ;氨基酸序列与小鼠及人的同一性分别为88%、92% ;功能结构域序列与小鼠及人的同一性为99%和100%,具有高度的同源性。该蛋白的分子量(MW)为29.8kDa,等电点(PI)为8.61,是一碱性蛋白,具有与小鼠相似的亲水性线性抗原表位。利用蛋白功能结构检索的方法发现它具有TGF-β前导肽的部分序列和TGF-β功能结构域的完整序列,用同源建模的方法发现该蛋白的空间构象与小鼠的完全一致。(2)成功构建了pET28a(+)-SjTGF-β1原核表达载体,经IPTG诱导后可在大肠杆菌BL21(DE3)中表达了重组融合蛋白,主要以包涵体的形式存在,重组菌和包涵体的蛋白条带均可被兔抗鼠TGF-β1多克隆抗体所识别。(3)将Sj和小鼠的TGF-β1核苷酸序列比对后,在两者有差异的cDNA区域设计各自的特异性引物,分别以Sj和小鼠的cDNA为模板进行特异性产物的扩增,以SjcDNA为模板、用SjTGF-β1引物扩增和以小鼠cDNA为模板、用小鼠TGF-β1引物扩增时,均分别得到约250bp的特异性PCR产物,以SjcDNA为模板、用小鼠TGF-β1引物扩增及以小鼠cDNA为模板、用SjTGF-β1引物进行扩增时,无特异性条带,确定TGF-β1基因在日本血吸虫雌、雄虫中特异性转录。(4)利用荧光定量PCR技术检测SjTGF-β1基因在尾蚴、虫卵、雌、雄成虫期均有转录;在肝组织中虫体感染早期的转录水平高,感染21天时转录水平降低,随着感染时间的延长和疾病慢性化的进程,第8周时降至最低,第12周时又逐渐上升,感染晚期又恢复至高水平。(5)Western blot实验结果显示,分子量约为50kDa附近,雌、雄成虫和各期感染小鼠的肝脏中均有一目的条带的出现,该条带可能为TGF-β1的无活性潜在相关肽(LAP),且雄虫的表达高于雌虫,小鼠感染后期表达更为显著。(6)利用ELISA技术检测感染小鼠血浆中总TGF-β1的水平随着感染时间的延长而升高。(7)免疫组化技术发现正常组小鼠肝组织切片有少量的TGF-β1表达,在感染小鼠的肝脏组织中,TGF-β1的表达水平随着感染时间的延长表达水平逐渐增强。感染后期,虫卵肉芽肿周围、汇管区附近的TGF-β1的表达更高。结论:(1)已获得SjTGF-β1基因部分核苷酸序列长约777bp,其编码258个氨基酸,具有部分的前导肽序列和完整的功能结构域序列,与小鼠和人的氨基酸序列有高度的同源性。但仍未获得该基因的全长序列。(2)成功构建原核表达载体pET28a(+)-SjTGF-β1,经IPTG诱导后表达出重组融合蛋白,主要以包涵体的形式存在,可被兔抗小鼠TGF-β1多克隆抗体识别,具有免疫反应性。(3)SjTGF-β1基因在日本血吸虫虫卵、尾蚴、成虫各期均特异转录。(4)Sj感染各期小鼠肝脏中,该基因在感染早期的转录水平较高,虫体感染21天时转录水平下降,8周时降至最低,12周时逐渐上升,感染后期又恢复至高水平,表明SjTGF-β1在整个感染过程中可能参与了致肝纤维化的作用,同时也以自我保护的方式参与免疫逃避。(5)Sj总蛋白中不同形式的TGF-β1可被兔抗小鼠TGF-β1多克隆抗体识别,表明Sj体内有TGF-β1样基因表达。(6)日本血吸虫感染小鼠血浆和肝脏中的总TGF-β1的水平随着感染时间的延长而升高,推测日本血吸虫病性肝纤维化有可能是虫源性TGF-β1和宿主源性TGF-β1共同作用的结果。