论文部分内容阅读
第一部分HSF2影响肠上皮细胞层在溃疡性结肠炎中的作用研究[目 的]在临床层面初步观察溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis,UC)不同疾病活动度患者肠黏膜组织内热休克转录因子2(Heat shock transcription factor 2,HSF2)与肠上皮细胞层标志物之间的相关性。在动物和细胞层面改变其HSF2水平,继续探索HSF2与肠上皮细胞层标志物之间的相关性。旨在明确HSF2在UC中对肠上皮细胞层的作用。[方法]1.临床层面:纳入健康对照者及轻、中、重度UC患者各15例,在结肠镜下取肠黏膜组织用于RT-qPCR和免疫组化,分别检测临床水平UC不同疾病活动度患者肠黏膜组织内HSF2、ZO-1、Occludin基因转录和蛋白表达的情况。2.动物层面:利用本研究团队前期建系繁育的hsf2-/-小鼠(KO)和C57BL/6野生型(Wildtype,WT)小鼠,根据是否饮用葡聚糖硫酸钠(Dextransulphate sodium,DSS)诱导结肠炎分为WT小鼠对照组(WT+H20组,雄性10只)、HSF2敲除小鼠对照组(KO+H2O组,雄性10只)、WT小鼠结肠炎组(WT+DSS组,雄性10只)和HSF2敲除小鼠结肠炎组(KO+DSS组,雄性10只)。取各实验组小鼠肠黏膜组织用于RT-qPCR和Western blot,分别检测不同HSF2水平小鼠ZO-1、Occludin基因转录和蛋白表达的情况。3.细胞层面:采用HSF2干扰和过表达慢病毒转染改变Caco-2细胞HSF2水平,随后根据是否使用脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)诱导炎症将Caco-2细胞分为非LPS作用组,即正常对照组(NC组)和LPS作用组(炎症对照组,NC+LPS组;炎症HSF2干扰组,shR-HSF2+LPS组;炎症HSF2干扰对照组,shR-V+LPS组;炎症HSF2过表达组,OE-HSF2+LPS组;炎症HSF2过表达对照组,OE-V+LPS组)。运用RT-qPCR、Western blot分别检测不同HSF2水平细胞ZO-1、Occludin基因转录和蛋白表达的情况;MTS比色法检测细胞增殖活性;流式细胞仪Annexin V-FITC/PI荧光双标法及免疫荧光法检测细胞凋亡水平。[结 果]1.临床层面:对比健康对照者而言,UC患者肠黏膜组织内HSF2基因转录和蛋白表达量随疾病严重程度的增加而上升;ZO-1、Occludin基因转录和蛋白表达量随疾病严重程度的增加而下降。2.动物层面:结肠炎组(WT+DSS组和KO+DSS组)小鼠肠黏膜组织内ZO-1、Occludin基因转录和蛋白表达量低于对照组(WT+H2O组和KO+H2O组),并且KO+DSS组较WT+DSS组更低,但WT+H2O组和KO+H2O组未见明显统计学差异。3.细胞层面:(1)Caco-2 细胞 LPS 作用组(NC+LPS 组、shR-HSF2+LPS组、shR-V+LPS 组、OE-HSF2+LPS 组和 OE-V+LPS 组)ZO-1、Occludin 基因转录和蛋白表达量以及细胞增殖活性均低于非LPS作用组(NC组),并且LPS作用组内OE-HSF2+LPS组最高,shR-HSF2+LPS组最低,其余三组(NC+LPS组,shR-V+LPS组和OE-V+LPS组)未见明显统计学差异;(2)Caco-2细胞LPS 作用组(NC+LPS 组、shR-HSF2+LPS 组、shR-V+LPS 组、OE-HSF2+LPS组和OE-V+LPS组)细胞凋亡水平高于非LPS作用组(NC组),并且LPS作用组内shR-HSF2+LPS组最高,OE-HSF2+LPS组最低,其余三组(NC+LPS组,shR-V+LPS组和OE-V+LPS组)未见明显统计学差异。[结 论]1.UC患者疾病严重程度与肠黏膜组织内HSF2基因转录和蛋白表达量呈正比,与ZO-1、Occludin基因转录和蛋白表达量呈反比。随着UC患者疾病严重程度的增加,肠上皮细胞层的损伤也逐渐加重。2.结肠炎组小鼠肠黏膜组织内HSF2水平与ZO-1、Occludin基因转录和蛋白表达量呈正比。结肠炎组小鼠肠黏膜组织内肠上皮细胞层的损伤较对照组严重,且结肠炎组小鼠HSF2基因的敲除会加剧肠上皮细胞层的损伤。3.炎症环境下Caco-2细胞HSF2水平与ZO-1、Occludin基因转录和蛋白表达量以及细胞增殖活性呈正比,与细胞凋亡水平呈反比。4.HSF2可能通过对抗肠上皮细胞层损伤在UC中发挥保护作用。第二部分HSF2调控肠上皮细胞线粒体途径凋亡在溃疡性结肠炎中的作用机制研究[目 的]在临床层面初步观察UC不同疾病活动度患者肠黏膜组织内肠上皮细胞凋亡及线粒体途径活化水平。在动物和细胞层面改变其HSF2水平,继续观察炎症环境下肠上皮细胞凋亡,并探索不同HSF2水平对线粒体途径活化的作用。旨在明确HSF2是否在UC中通过线粒体途径调控肠上皮细胞凋亡。[方 法]1.临床层面:透射电镜下观察健康对照者及轻、中、重度组UC患者肠黏膜组织内肠上皮细胞凋亡,并运用免疫组化检测肠黏膜组织内Bax、Cleaved Caspase-9 和 Cleaved Caspase-3 蛋白表达的情况。2.动物层面:透射电镜下观察各实验组(WT+H2O组、KO+H2O组、WT+DSS组和KO+DSS组)小鼠肠黏膜组织内肠上皮细胞凋亡,并运用免疫组化检测肠黏膜组织内Bax、Cleaved Caspase-9和Cleaved Caspase-3蛋白表达的情况,Western blot 检测肠黏膜组织内 Bax、Cleaved Caspase-9、Cleaved Caspase-3 和胞浆Cyto-C蛋白表达的情况。3.细胞层面:透射电镜下观察各实验组(NC组、NC+LPS组、shR-HSF2+LPS组、shR-V+LPS 组、OE-HSF2+LPS 组和 OE-V+LPS 组)Caco-2 细胞凋亡,并运用 Western blot 分别检测 HSF2 干扰组(NC 组、NC+LPS 组、shR-HSF2+LPS 组和shR-V+LPS组)和过表达组(NC组、NC+LPS组、OE-HSF2+LPS组和OE-V+LPS 组)Caco-2 细胞 Bax、Cleaved Caspase-9、Cleaved Caspase-3 和胞浆Cyto-C蛋白表达的情况。[结 果]1.临床层面:透射电镜下健康对照者及轻、中、重度组UC患者肠黏膜组织内肠上皮细胞均观察到细胞凋亡现象;肠黏膜组织内Bax、Cleaved Caspase-9和Cleaved Caspase-3蛋白表达水平随UC疾病严重程度的增加而升高。2.动物层面:透射电镜下各实验组小鼠肠黏膜组织内肠上皮细胞均观察到细胞凋亡现象;肠黏膜组织内Bax、Cleaved Caspase-9、Cleaved Caspase-3和胞浆Cyto-C蛋白表达量与小鼠HSF2水平呈反比。3.细胞层面:透射电镜下各实验组Caco-2细胞均观察到细胞凋亡现象;Caco-2 细胞 Bax、Cleaved Caspase-9、Cleaved Caspase-3 和胞浆 Cyto-C 蛋白表达量与细胞HSF2水平呈反比。[结 论]1.UC患者肠黏膜组织内细胞凋亡线粒体途径活化程度与疾病严重程度呈正比。2.结肠炎组小鼠肠黏膜组织内细胞凋亡线粒体途径活化程度高于对照组。结肠炎组小鼠HSF2水平与细胞凋亡线粒体途径活化程度呈反比,HSF2基因的敲除会促进结肠炎组小鼠肠黏膜组织内线粒体途径活化。3.炎症环境下Caco-2细胞HSF2水平与细胞凋亡线粒体途径活化程度呈反比,干扰HSF2会促进线粒体途径活化;反之,过表达HSF2则抑制线粒体途径活化。4.HSF2可能通过抑制线粒体途径减少肠上皮细胞过度凋亡在UC中发挥保护作用。第三部分HSF2调控Caco-2细胞线粒体膜通透性转换孔的作用机制研究[目 的]探索不同HSF2水平Caco-2细胞炎症模型线粒体膜通透性改变情况,旨在明确HSF2是否通过调控线粒体膜通透性转换孔(Mitochondria permeability transition pore,mPTP)抑制肠上皮细胞线粒体途径凋亡在UC中发挥保护作用。[方法]分别运用流式细胞仪检测各实验组(NC组、NC+LPS组、shR-HSF2+LPS组、shR-V+LPS 组、OE-HSF2+LPS 组和 OE-V+LPS 组)Caco-2 细胞 mPTP 开放程度、激光共聚焦显微镜观察线粒体膜电位变化;使用mPTP激动剂Atr、抑制剂CsA作用Caco-2细胞后(分组为:NC组、NC+LPS组、shR-HSF2+LPS组、OE-HSF2+LPS 组、NC+Atr+LPS 组、NC+CsA+LPS 组、OE-HSF2+Atr+LPS 组和shR-HSF2+CsA+LPS组)再次进行上述两项实验检测。[结 果]1.LPS 作用组(NC+LPS 组、shR-HSF2+LPS 组、shR-V+LPS 组、OE-HSF2+LPS组和OE-V+LPS组)mPTP开放细胞阳性率均高于非LPS作用组(NC组),且在LPS作用组内shR-HSF2+LPS组最高,OE-HSF2+LPS组最低,其余三组(NC+LPS组,shR-V+LPS组和OE-V+LPS组)未见明显统计学差异。2.LPS作用组线粒体膜电位均较非LPS作用组降低,且LPS作用组内shR-HSF2+LPS组降低幅度最大,OE-HSF2+LPS组降低幅度最小,其余三组(NC+LPS组,shR-V+LPS组和OE-V+LPS组)未见明显统计学差异。3.NC+CsA+LPS 组和 OE-HSF2+LPS 组、NC+Atr+LPS 组和 shR-HSF2+LPS组的mPTP开放细胞阳性率未见明显统计学差异;OE-HSF2+Atr+LPS组的mPTP开放细胞阳性率低于NC+Atr+LPS组;shR-HSF2+CsA+LPS组的mPTP开放细胞阳性率高于NC+CsA+LPS组。4.NC+CsA+LPS 组和 OE-HSF2+LPS 组、NC+Atr+LPS 组和 shR-HSF2+LPS组的线粒体膜电位未见明显统计学差异;OE-HSF2+Atr+LPS组的线粒体膜电位高于NC+Atr+LPS组;shR-HSF2+CsA+LPS组的线粒体膜电位低于NC+CsA+LPS组。[结 论]1.Caco-2细胞HSF2水平与线粒体膜通透性呈反比,干扰HSF2会促进mPTP开放,使线粒体膜电位下降,类似mPTP激动剂Atr的效应;反之,过表达HSF2会抑制mPTP开放,减少线粒体膜电位的下降幅度,类似mPTP抑制剂CsA的效应。2.HSF2能对抗Atr引起的mPTP过度开放,对Atr引起的线粒体膜通透性增加具有回复作用。3.HSF2可能通过抑制mPTP的开放减少线粒体途径凋亡的活化程度在UC中发挥保护作用。