昆虫作为无脊椎动物,并不像高等动物一样具备获得性免疫,在长期的进化过程中只能依靠自身的天然免疫系统以抵御病原物的入侵。昆虫天然免疫由体液免疫和细胞免疫组成。黑化反应及Toll通路作为体液免疫的重要组成部分,分别通过产生黑化包裹和抗菌肽以杀灭病原物,而这两个过程的完成都需要胞外丝氨酸蛋白酶级联的参与来完成。Serpin类丝氨酸蛋白酶抑制剂作为负调控因子,通过对丝氨酸蛋白酶级联的精确调控来防止过度免疫对生物体造成伤害。Serpin在免疫过程中发挥重要的调控作用,目前关于鳞翅目昆虫中serpin的研究报道主要集中在烟草天蛾中,家蚕作为鳞翅目昆虫的模式生物,其serpin功能的报道却相对较少。本研究以家蚕serpin32为对象,对其在家蚕免疫过程中的功能进行了探究,为深入研究家蚕天然免疫通路的激活与调控过程奠定基础。主要研究结果如下:1.Bmserpin32基本信息分析、克隆、原核表达纯化及抗体制备首先我们利用软件对Bmserpin32进行基本信息分析,Bmserpin32蛋白由395个氨基酸残基组成,分子量约为43.9 kDa,等电点为4.76,靠近N端的20个氨基酸为其信号肽。将Bmserpin32的氨基酸序列与13种其它昆虫的serpin构建了进化树,发现Bmserpin32与烟草天蛾serpin7进化关系最近,聚为一小支,进一步对Bmserpin32与Msserpin7进行了多重序列比对,比对结果显示二者同源性高达64%,且P1活性切割位点均为精氨酸R。该结果暗示Bmserpin32可能和Msserpin7发挥类似的功能,即参与调控由clip丝氨酸蛋白酶所介导的级联反应。随后我们克隆了Bmserpin32,将其与带有His标签的p28载体连接后转化到大肠杆菌BL21(DE3)表达菌株中,在16℃经IPTG诱导20 h后收集菌体,超声破碎后离心,将上清蛋白进行镍离子柱亲和层析纯化,用不同浓度梯度的咪唑进行洗脱。重组Bmserpin32蛋白主要在50 mM,100 mM和200 mM咪唑浓度被洗脱下来,收集洗脱液超滤浓缩后,采用分子筛S75进一步纯化得到了纯度较高的蛋白。经His-标签抗体确认后,10 mg重组Bmserpin32蛋白送南京钟鼎生物技术公司制备获得了Bmserpin32多克隆抗体。2.重组Bmserpin32蛋白活性分析为了分析原核表达获得的重组Bmserpin32蛋白是否具备抑制活性,我们以FITC-酪蛋白作为底物,测定了Bmserpin32对商业化的6种蛋白酶:胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶、蛋白酶K、枯草杆菌蛋白酶和木瓜蛋白酶的抑制活性。结果显示Bmserpin32对胰蛋白酶的活性有着极显著的抑制作用,且用不同温度和pH处理Bmserpin32蛋白后,在处理温度为20-60℃,处理pH为6-10时,Bmserpin32对胰蛋白酶仍然保持较高的抑制活性。将Bmserpin32与胰蛋白酶孵育后的混合物经SDS-PAGE和western blot检测发现,Bmserpin32是通过与胰蛋白酶结合形成稳定的共价复合物从而抑制其活性的。随后,将Bmserpin32与胰蛋白酶孵育后,利用MALDI-TOF/TOF质谱仪检测电离的肽段,发现肽段大小与Bmserpin32蛋白第359位精氨酸(R)后的氨基酸残基片段大小一致,该结果表明Bmserpin32蛋白在抑制胰蛋白酶活性时359位精氨酸与360位的异亮氨酸(I)之间的肽键发生了断裂,359位的精氨酸与胰蛋白酶结合形成共价复合物。为了进一步验证活性切割位点的正确性,我们将Bmserpin32蛋白第359位的精氨酸突变为丙氨酸(A),通过原核表达纯化获得了突变体R359A蛋白,测定了其对胰蛋白酶的抑制活性,结果显示与野生型Bmserpin32蛋白相比,突变后的R359A蛋白确实失去了对胰蛋白酶的抑制活性。这些结果表明,Bmserpin32是通过其第359位的精氨酸与胰蛋白酶的活性中心结合,形成共价复合物,从而抑制胰蛋白酶的催化活性。3.家蚕Bmserpin32功能分析对5龄第3天的家蚕注射大肠杆菌和藤黄微球菌后,检测Bmserpin32在脂肪体、表皮、血细胞中的表达量。qPCR结果显示,脂肪体中Bmserpin32的表达水平表现为诱导下调或无显著差异,表皮中Bmserpin32的表达水平在注射12 h后显著性上调,血细胞中Bmserpin32的表达水平在注射后的6-24 h均显著性上调;western blot结果显示,血淋巴中Bmserpin32蛋白表达量在注射后的6 h和12 h被诱导上调了。为了探究Bmserpin32在免疫过程中是否参与对抗菌肽基因表达的调控,选取5龄第3天的家蚕注射了Bmserpin32蛋白,30 min后再注射藤黄微球菌以激活免疫通路,qPCR检测抗菌肽的表达情况。结果显示在注射Bmserpin32后,抗菌肽Gloverin2、CecropinA和Defensin2在免疫组织中的表达与对照相比并没有显著性差异,由此推测在家蚕天然免疫过程中,Bmserpin32可能并不能对抗菌肽基因的表达发挥调控作用。为了研究Bmserpin32是否参与对家蚕血淋巴黑化的抑制,将Bmserpin32蛋白与家蚕幼虫的血淋巴体外孵育。随着时间的增加,加入了重组Bmserpin32蛋白的血淋巴样品黑化过程变得缓慢,且当重组Bmserpin32的加入量由1μg增加到10μg时,黑化反应被抑制的程度也更加明显,表明Bmserpin32在黑化的产生过程发挥着重要的调控作用。为了进一步阐明Bmserpin32在抑制黑化过程中的具体作用,我们检测了Bmserpin32对酚氧化酶原(PPO)激活通路和酚氧化酶(PO)活性的调控,以L-Dopa为底物测定血淋巴样品中PO的活性。与对照组相比,在加入Bmserpin32蛋白之后再经藤黄微球菌诱导,PO的活性被显著性下调。然而,若先加入藤黄微球菌激活PPO通路,再加入Bmserpin32蛋白,则对PO活性没有抑制作用。该结果表明,Bmserpin32并非直接抑制黑化过程,而是通过抑制PPO的激活过程以达到抑制黑化的效果。为了分析Bmserpin32对家蚕丝氨酸蛋白酶的抑制作用,我们以家蚕中与烟草天蛾serpin7的靶蛋白酶PAP3同源性最高的CLIP18蛋白为靶标,将其与Bmserpin32体外孵育后利用Bmserpin32的抗体进行了western blot检测。CLIP18前体经Xa因子激活后再与Bmserpin32孵育,在70-100 kDa之间检测到了结合条带。该实验表明,在家蚕中Bmserpin32可能通过抑制BmCLIP18从而发挥调控作用。