论文部分内容阅读
恶性肿瘤是威胁人类健康的常见疾病。目前治疗肿瘤的方法主要包括手术、化学药物治疗和放射治疗。手术治疗在切除病灶的同时,也对机体的正常组织器官造成了极大的损伤。化疗和放疗在杀伤肿瘤细胞的同时,也产生了很大的毒副作用,严重影响患者的生活质量,且机体易产生耐药性,不利于后续治疗。随着医疗技术的不断发展,专家学者逐渐意识到肿瘤的生物遗传异质性和个体间的遗传差异性对于肿瘤的治疗会产生显著的影响,针对肿瘤的靶向治疗应运而生。溶瘤病毒是一种能够靶向肿瘤,并在肿瘤细胞中特异性复制,杀伤肿瘤细胞却不损伤正常细胞的新兴抗肿瘤药物。新城疫病毒能够在干扰素（Interferon,IFN）信号通路缺陷的癌细胞中大量复制,在正常细胞内由于抗病毒反应无法进行复制,因而具有一定的溶瘤活性。白介素8（Interleukin-8,IL-8）是一种粒细胞趋化因子,能够募集和激活中性粒细胞,同时对嗜酸性粒细胞、淋巴细胞也有一定的作用。因此,本研究利用反向遗传技术构建携带IL-8基因的重组Lasota亚型新城疫病毒,探究重组病毒对人肿瘤细胞的体内外杀伤效果,为进一步探寻有效的肿瘤靶向治疗新药物提供了实验基础。目的:利用反向遗传技术构建携带并验证人IL-8外源基因的重组新城疫病毒。方法:本研究设计了携带新城疫病毒（Newcastle Disease Virus,NDV）的Lasota毒株载体PmeⅠ酶切位点上下游同源序列的IL-8基因序列的特异引物用于PCR扩增合成的pc DNA3.1质粒中的目的基因,将扩增出的目的基因与使用PmeⅠ酶切后线性化的Lasota病毒载体运用同源重组酶连接后,将产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中。菌落形成后,挑选单个克隆菌落摇菌,提取其中质粒进行1%琼脂糖凝胶电泳鉴定,将阳性结果的质粒进行PCR扩增后送去上海生工生物工程有限公司测序。将获得的序列在BLAST网站进行比对。使用脂质体转染体系在BSR细胞中共转染重组病毒质粒与NDV辅助核蛋白（Nuclear protein,NP）、磷蛋白（Phosphoprotein,P）和大聚合酶蛋白（Large polymerase protein,L）辅助质粒,拯救出重组病毒。利用9日龄鸡胚大量扩增重组病毒,收取尿囊液进行血液凝集实验检测病毒效价后,运用逆转录-聚合酶链反应（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR）鉴定IL-8是否插入成功。检测重组病毒感染力的50%组织细胞感染量（Tissue Culture Infective Dose,TCID50）。在不同细胞感染重组病毒后利用针对新城疫病毒的抗体做细胞间接免疫荧光验证重组病毒在细胞中的复制能力。使用Human IL-8 ELISA试剂盒检测重组病毒感染肝癌细胞Hep G2后IL-8的表达情况。将1MOI的重组新城疫病毒感染肿瘤细胞,在显微镜下观察细胞形态变化。结果:使用特异引物进行PCR扩增获得了目的片段h TERT-IL-8-Cherry。目的基因与线性化Lasota病毒载体连接后,提取单个克隆菌落的质粒,1%琼脂糖凝胶电泳鉴定结果与目的片段大小吻合,测序结果与实验方案设计的序列在BLAST网站比对一致,表明重组病毒质粒Lasota-h TERT-IL-8-Cherry构建成功。使用脂质体转染体系成功拯救出重组病毒NDV-h TERT-IL-8-Cherry,命名为NDV-IL-8。提取鸡胚扩毒的尿囊液RNA进行RT-PCR鉴定,电泳结果表明IL-8基因成功插入Lasota病毒基因组中。重组新城疫病毒的TCID50为10-5.333。间接免疫荧光结果说明,重组病毒在肿瘤细胞中大量复制,在正常细胞中复制受限,同时,Cherry示踪蛋白的正常表达也间接说明了IL-8的表达。ELISA检测结果表明,重组病毒感染肝癌细胞Hep G2后IL-8高表达。在显微镜下观察到以1MOI的病毒感染细胞48h后,细胞开始出现串珠样的细胞病变情况。结论:成功构建了表达人IL-8基因的重组新城疫病毒NDV-IL-8,为进一步研究重组病毒体内外抗肿瘤效应奠定了基础。