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目的:本研究主要观察维生素K3在体外诱导肝癌HuH7细胞氧化应激过程中对ERK通路和Keap1-Nrf2-ARE信号途径的影响;并采用关键分子的阻断剂观察ROS-ERK-Nrf2信号通路是否与维生素K3的抗肝癌效果存在一定的关联;初步探讨维生素K3抗肝癌的分子机制,从而为临床肝癌治疗提供一定的理论依据。 方法: 1.维生素K3诱导肝癌HuH7细胞氧化应激指标的检测。 随机将肝癌HuH7细胞分成四组:不同浓度(0μM、2μM、5μM、10μM)维生素K3作用组。上述浓度的维生素K3作用HuH7细胞24h后,用DCFH-DA免疫荧光法检测各实验组细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平的变化;用分光光度法检测上述各组细胞内GSH、SOD和MDA水平的变化。 2.维生素K3对肝癌HuH7细胞ERK信号传导通路的影响。 不同浓度(0μM、2μM、5μM、10μM)维生素K3分别处理肝癌HuH7细胞48h后,蛋白印迹法检测上述各组细胞内ERK、磷酸化ERK水平,并进行剂量效应相关性分析。 3.维生素K3对肝癌HuH7细胞Ⅱ相酶诱导的信号通路的影响。 不同浓度(0μM、2μM、5μM、10μM)维生素K3分别处理肝癌HuH7细胞48h后,蛋白印迹法检测Keap1-Nrf2-ARE信号通路上Keap1蛋白、总Nrf2蛋白及其调控基因NQO1和HO-1蛋白水平表达的变化;蛋白印迹法检测Nrf2蛋白在胞浆与胞核的分布变化,并进行剂量效应相关性分析。 4.用关键分子阻断剂验证ROS-ERK-Nrf2信号通路是否与维生素K3反应相关联。 (1)肝癌HuH7细胞随机分为:空白对照组、ERK阻断剂(PD98059)组、10μM维生素K3组、10μM维生素K3+ERK阻断剂(PD98059)组;蛋白印迹法分别检测上述各组HuH7细胞内Nrf2、NQO1和HO-1蛋白表达变化。 (2)肝癌HuH7细胞随机分为:空白对照组、NQO1抑制剂Dicoumarol组、HO-1抑制剂ZNPPIX组、10μM维生素K3组、10μM维生素K3+ NQO1抑制剂 Dicoumarol组、10μM维生素K3+HO-1抑制剂ZNPPIX组;蛋白印迹法分别检测上述各实验组HuH7细胞内NQO1和HO-1蛋白表达变化。 (3)采用CCK-8法、流式细胞术等手段分析上述信号通路阻断剂联合应用对维生素K3作用肝癌细胞HuH7敏感性的影响。 结果: 1.DCFH-DA免疫荧光法检测发现:与0μM组相比较,上述不同浓度(2μM、5μM、10μM)维生素K3作用肝癌HuH7细胞24h后,胞内ROS水平明显增加,并呈现一定的浓度梯度依赖性;上述浓度的维生素K3作用肝癌HuH7细胞24h后,细胞内GSH和SOD的活性均明显提高(P均<0.05),亦呈一定的浓度梯度依赖性;48h后上述各实验组细胞内GSH和SOD的活性均有不同程度降低(P均<0.05 vs24 h),呈一定的时间相关性。 2.不同浓度(2μM、5μM、10μM)维生素K3分别处理肝癌HuH7细胞48h后,磷酸化的ERK蛋白表达呈现渐进性升高,均高于0μM组(P均<0.05),并呈一定的浓度梯度依赖性;但总ERK蛋白无明显改变(P均>0.05)。 3.与0μM组相比,不同浓度(2μM、5μM、10μM)维生素K3与肝癌HuH7细胞共同孵育48h后,上述各实验组细胞内Nrf2、NQO1和HO-1的蛋白表达显著提高(P均<0.05),并呈一定的浓度梯度依赖性;而Keap1蛋白表达无明显变化(P均>0.05);与此同时,上述各实验组细胞胞浆内Nrf2蛋白表达显著下降(P均<0.05),而细胞核内Nrf2蛋白表达显著上升(P均<0.05),并均呈现一定的浓度梯度依赖性。 4.蛋白印迹检测发现:ERK通路的特异性阻断剂(PD98059)可以明显抑制维生素K3诱导的肝癌细胞HuH7胞内Nrf2、NQO1和HO-1蛋白表达(P均<0.05);同时维生素K3诱导的NQO1和HO-1的蛋白表达还可分别被特异的NQO1抑制剂Dieoumarol、HO-1抑制剂ZNppIX所抑制(P均<0.05); CCK-8法和流式细胞检测凋亡发现:ERK阻断剂(PD98059)、NQO1阻断剂(Dicoumarol)、HO-1阻断剂(ZNPPIX)均可提高维生素K3作用肝癌HuH7细胞的敏感性(P均<0.05)。 结论: 1.维生素K3在肝癌HuH7细胞中可通过激活ROS-ERK-Nrf2信号通路从而上调Ⅱ相代谢酶NQO1和HO-1蛋白表达水平,并且呈一定的浓度和时间依赖性。 2.ROS-ERK-Nrf2信号通路可能与维生素K3抗肝癌反应存在一定的关联。