生肌因子5(Myf5)为生肌决定因子(MyoD)基因家族。MyoD基因家族包括生肌决定因子MyoD肌细胞生成素(Myogenin)、生肌因子5(Myf5)和生肌调节因子4(Mrf4),它们具有单独或协同调节肌细胞的增殖和分化、肌纤维大小和数量等功能。为了建立利用小鼠Myf5基因诱导绵羊骨髓间充质干细胞为成肌细胞的方法,本研究在克隆小鼠Myf5基因的cDNA基础上,依次通过克隆载体pMD18-T Simple和表达载体pcDNA3.1(+)相连,构建真核表达载体pcDNA3.1-Myf5;采用脂质体法将pcDNA3.1-Myf5转染绵羊骨髓间充质干细胞,以观察转染细胞分化形成成肌细胞的能力。其研究结果如下：1.Myf5基因真核表达载体的构建参照GenBank (AK044894)中序列,通过PCR扩增提取小鼠肌肉组织中的总RNA,扩增获得Myf5基因,与克隆载体pMD18-T Simple相连,通过双酶切和测序鉴定后,与表达载体pcDNA3.1(+)表达载体连接。经双酶切鉴定和测序结果显示,与理论序列相符,表明成功获得Myf5基因的真核表达载体pcDNA3.1-Myf5;2.骨髓间充质干细胞转染和分化将冷冻保存的绵羊骨髓间充质干细胞,经复苏后进行传代培养,其结果,培养细胞呈现正常的形态和生长曲线；当传代培养后细胞约达到80%汇合时,分别进行下列处理。A组：转染pcDNA3.1-Myf5无内毒素质粒,并加入含有0.5%DMSO的F12培养基；B组：转染pcDNA3.1-Myf5无内毒素质粒,加入F12培养基；C组：含0.5%DMSO的F12培养基。当转染后第12d开始,在倒置显微镜下,3组转染细胞均呈现成肌细胞样的细管状形态。3.转染细胞生物学检测(1)免疫荧光检测在转染细胞传代培养后的第17d,将上述3种细胞和作为对照未经转染的骨髓间充质干细胞,用兔MyoD、MyoG、DES抗体处理进行免疫荧光检测。其结果,与对照组不发生绿色荧光相比,三组转染细胞均出现绿色荧光；(2)流式细胞筛选在转染细胞传代培养后的第21d,利用BD Accuri-C6个人型流式细胞仪对3组转染细胞进行流式细胞筛选检测,其结果,三组细胞中三种基因表达(Desmin、MyoD、MyoG)都在96.4%以上(A组,98.6%、99.9%、96.9%；B组,99.9%、98.0%、99.1%;C组,97.4%、96.4%、99.9%)(3) Real-Time PCR检测在转染细胞传代培养后的第28d,对上述三种细胞和作为对照的骨髓间充质干细胞采用实时定量PCR检测(选取三对引物分别为MyoG,Myf5和Desmin,一组内参引物GAPDH)。其结果,与转染前细胞(标准化为1)相比,上述三种处理组的Myf5、MyoG和Desmi的相对表达量与均升高(A组分别为5.126±0.01倍、4.315±0.01倍和3.099+0.01倍；B组分别为4.484±0.01倍、3.124±0.01倍和2.889±0.01倍；C组分别为3.321±0.01倍、2.557±0.01倍和2.712±0.01倍)。上述结果表明,利用小鼠Myf5基因构建的pcDNA3.1-Myf5真核表达载体可以诱导绵羊骨髓间充质干细胞分化为成肌细胞。为BMSCs在组织工程中的进一步应用提供理论依据和技术支持。