本文以柿单宁主要特征结构单元表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)及其A型连接的二聚体(A型EGCG二聚体)为研究对象,旨在阐明A型EGCG二聚体具备较强抗淀粉样聚集活性的原因。首先,我们通过Thioflavin T(ThT)荧光、1-anilinonaphthalene-8-sulfonic(ANS)荧光、傅里叶变换红外光谱(FTIR)、圆二色光谱和透射电子显微镜等手段系统证实了A型EGCG二聚体具有比EGCG单体更强的抑制牛胰岛素淀粉样纤维形成及解聚成熟牛胰岛素淀粉样纤维的效果,并探究了A型EGCG二聚体发挥抑制作用的关键阶段。进一步通过构建PC12细胞模型研究了EGCG和A型EGCG二聚体对牛胰岛素淀粉样纤维神经细胞毒性的抑制作用和调节机制。在此基础上,以Aβ40淀粉样多肽为模型,通过ESI-MS、核磁共振、分子对接等研究手段探索EGCG和A型EGCG二聚体与Aβ40淀粉样多肽的结合方式和相互作用位点。主要研究结果如下:1.EGCG和A型EGCG二聚体对牛胰岛素淀粉样纤维形成抑制作用的比较研究ThT荧光实验结果表明,牛胰岛素蛋白在pH 2.0的含20%乙酸溶液中孵育8 h可形成成熟的牛胰岛素淀粉样纤维。加入EGCG和A型EGCG二聚体对牛胰岛素淀粉样纤维的形成均可发挥显著的抑制作用,且抑制作用随着多酚浓度增大而增强。相较于EGCG单体,A型EGCG二聚体效果更好,当其浓度达到0.35m M时,可完全阻止牛胰岛素淀粉样纤维的形成。透射电子显微镜观察结果与ThT荧光实验结果相符。加入0.70 m M的A型EGCG二聚体后,在透射电子显微镜中观察不到淀粉样纤维状结构,但有部分无定型聚集体形成。此外,采用动态光散射检测发现A型EGCG二聚体可保护一部分牛胰岛素蛋白继续以单体形式存在,同时生成了粒径约为295 nm的无定型聚集体。ANS荧光、FTIR和圆二色光谱的研究结果表明,A型EGCG二聚体可较好地保护牛胰岛素蛋白的原始构象,阻止蛋白二级结构的改变及内部疏水性氨基酸的暴露。因此,我们推测与牛胰岛素蛋白单体结合并抑制蛋白结构改变是A型EGCG二聚体发挥抑制牛胰岛素淀粉样纤维形成作用的机制之一。为了研究A型EGCG二聚体抑制牛胰岛素淀粉样纤维形成的关键时期,在牛胰岛素蛋白孵育过程的不同时期加入0.70m M的A型EGCG二聚体,从结果中可以看出,在0 h和2 h时加入0.70 m M A型EGCG二聚体可完全抑制牛胰岛素蛋白疏水性氨基酸的暴露及牛胰岛素淀粉样纤维化聚集进程,并阻止原纤维的形成,促进无定型聚集体的形成,这表明A型EGCG二聚体不仅能够与牛胰岛素蛋白单体结合,还可与成核寡聚体结合,并破坏其原有结构,从而达到使其丧失继续形成原纤维的能力。然而,在4 h时加入A型EGCG二聚体仅能部分抑制牛胰岛素淀粉样纤维的形成。因此,以上研究结果证实,牛胰岛素淀粉样纤维形成过程中的延滞期是A型EGCG二聚体抑制牛胰岛素淀粉样纤维形成的关键阶段。2.EGCG和A型EGCG二聚体对成熟牛胰岛素淀粉样纤维解聚作用的比较研究ThT荧光和ANS荧光检测结果表明A型EGCG二聚体可显著减少牛胰岛素淀粉样纤维疏水性氨基酸的暴露,且A型EGCG二聚体的解聚效果强于EGCG单体。透射电子显微镜的观察结果可进一步证实A型EGCG二聚体具有更强的解聚成熟牛胰岛素淀粉样纤维的能力。通过SDS-PAGE电泳和Bradford法分别分析成熟牛胰岛素淀粉样纤维解聚产物分子量分布和上清液中可溶性蛋白含量变化,可以看到牛胰岛素淀粉样纤维解聚后形成了大量的分子量为10 k Da到250k Da的聚集体,且A型EGCG二聚体加入后生成的可溶性蛋白浓度为加入EGCG时的3.68倍,这表明A型EGCG二聚体不仅对已形成的牛胰岛素淀粉样纤维具有更好的解聚效果,还能促进可溶性牛胰岛素寡聚体的大量形成。3.EGCG和A型EGCG二聚体对由牛胰岛素淀粉样纤维诱导形成的神经细胞毒性的抑制作用及机制选用PC12细胞模型研究了EGCG和A型EGCG二聚体对牛胰岛素淀粉样纤维细胞毒性的抑制作用。MTT实验结果表明EGCG和A型EGCG二聚体可显著抑制牛胰岛素淀粉样纤维诱导产生的细胞毒性。相较于EGCG,A型EGCG二聚体可更好地保护PC12细胞免受牛胰岛素淀粉样纤维引起的损伤。实验结果表明,相较于EGCG,A型EGCG二聚体可更好地保护PC12细胞膜完整性,降低由牛胰岛素淀粉样纤维诱导的胞内过量Ca2+、活性氧(ROS)和一氧化氮(NO)浓度,阻止线粒体膜电位下降,提高胞内过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)等抗氧化防御酶活性,抑制细胞内凋亡诱导因子(AIF)和核酸内切酶G(Endo G)等凋亡相关蛋白的过量表达。因此,根据以上结果,我们推测清除细胞内过量的活性氧,并提高抗氧化防御酶活性是A型EGCG二聚体较好地保护PC12细胞免受牛胰岛素淀粉样纤维细胞毒性损伤的分子机制。4.以Aβ40淀粉样多肽为模型研究A型EGCG二聚体较强的淀粉样聚集抑制作用机理ThT荧光实验结果表明A型EGCG二聚体具有比EGCG单体更显著的抑制Aβ40淀粉样纤维形成的能力。30μM的A型EGCG二聚体可完全抑制Aβ40淀粉样多肽疏水性氨基酸残基的暴露和Aβ40淀粉样纤维化聚集进程。透射电子显微镜的观察结果可证实上述结论,30μM A型EGCG二聚体可促使无定型聚集体的形成,同时完全阻止Aβ40淀粉样纤维形成。未修饰蛋白光催化交联法和MTT法的检测结果均证实A型EGCG二聚体可较好地抑制Aβ40寡聚体的形成及其诱导的神经细胞毒性。随后,我们采用荧光淬灭、ESI-MS、核磁共振和分子对接等研究手段检测多酚与Aβ40多肽之间的相互作用机制,结果表明EGCG与A型EGCG二聚体均可与Aβ40多肽主要通过疏水相互作用结合形成非共价复合物。相较于EGCG,A型EGCG二聚体可与更多具有强烈聚集倾向的氨基酸残基结合,并与Aβ40多肽之间形成更多的非共价相互作用。最后,构效关系的研究结果表明多酚化学结构中的没食子酰基基团重要性强于羟基。