论文部分内容阅读
哺乳动物的精卵融合过程是个复杂而精巧的事件,需要一些特异性蛋白相互作用来介导。其中精子上的PDIA3(ERp57)是蛋白二硫键异构酶(protein disulfide isomerase, PDI)家族的成员,具有催化二硫键的功能,CRISP2是富含半胱氨酸的分泌蛋白(cysteine secretory proteins, CRISPs)家族的成员,具有16个保守的半胱氨酸和它们所形成的复杂的二硫键,这两种蛋白质都参与了精卵的融合过程,但是到目前为止这两种蛋白质在精卵结合与融合过程中的作用机制尚不清楚。我们猜测PDIA3可能会催化CRISP2分子中的二硫键从而引起其构象发生改变而介导精卵融合。为了验证这一想法,本实验构建了绒山羊PDIA3和CRISP2成熟肽和分段真核表达载体,用免疫共沉淀和酵母双杂交技术检测了PDIA3与CRISP2能否互相结合。首先根据本实验室克隆的绒山羊CRISP2(GU362703.1)和PDIA3的cDNA序列(GU985268.1),分析了它们的结构特点及其功能域后,将其各分为两段,即CRISP2A (24～176aa,去掉信号肽后)、CRISP2B (177～244aa)、PDIA3A (26～376aa,去掉信号肽后)和PDIA3B(377～505aa)段。在设计引物构建pcDNA真核表达载体的时候,给PDIA3(26～505aa)、PDIA3A和PDIA3B的C端加了HA标签,CRISP2(24～376aa)、CRISP2A和CRISP2B的C端加了6His标签,使用抗HA标签和His标签的单克隆抗体进行免疫共沉淀。把构建好的真核表达载体分成五组,即pcDNA-Pdia3和pcDNA-CRISP2、 pcDNA-Pdia3A和pcDNA-CRISP2A、pcDNA-Pdia3A和pcDNA-CRISP2B、pcDNA-Pdia3B和pcDNA-CRISP2A、 pcDNA-Pdia3B和pcDNA-CRISP2B。五组分别共转染人293T细胞系,进行了免疫共沉淀实验。实验结果显示：PDIA3A可以分别和CRISP2A、CRISP2B发生相互作用,而PDIA3B不能和CRISP2的任何一段发生作用。此外,用上述片段成功构建了酵母双杂交载体pGBK-Pdia3、pGBK-Pdia3A、pGBK-Pdia3B、pGAD-CRISP2、 pGAD-CRISP2A和pGAD-CRISP2B,然后像免疫共沉淀载体一样,也将酵母载体分成了五组,进行了五组酵母双杂交的实验。酵母双杂交的实验结果显示：PDIA3A可以分别和CRISP2A、CRISP2B发生相互作用,PDIA3B不能不参与任何作用。免疫共沉淀和酵母双杂交实验结果,初步证明了绒山羊PDIA3与CRISP2之间存在相互作用,并且通过对两个蛋白进行分段表达鉴定,也初步找到了二者发生相互作用的具体结构域,即PDIA3A (而非PDIA3B)能分别与CRISP2A和CRISP2B结合。实验结果暗示CRISP2可能是PDIA3的一种底物,为进一步鉴定由PDIA3直接引起CRISP2分子内的二硫键改变奠定了基础。