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脯氨酸羟化酶蛋白家族(PHDs)是位于细胞内的氧含量感应蛋白,是可直接感受氧分压变化的分子,其活性的发挥严格依赖于细胞内的氧分压。PHD2是PHDs家族中重要的氧感受器,广泛表达于上皮来源的组织中,是细胞内重要的氧/氧化还原敏感的蛋白酶。在氧分压正常的条件下,PHD2可通过氧依赖性的途径使缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)在蛋白酶体内快速的降解。在缺氧的条件下,PHD2降解HIF-1α活性受到抑制,形成缺氧反应调节通路,产生各种缺氧相关蛋白,维持细胞的能量代谢。缺氧是包括肝细胞肝癌(Hepatocellular Carcinoma,HCC)在内的多种实体肿瘤广泛存在的特征,既往研究主要集中在HIF-1介导的多种基因的转录激活,以及相应的调控机制。近年来的研究发现,PHD2活性的改变才是肿瘤细胞内诱发缺氧反应的始动环节。在许多肿瘤中,都可检测到PHD2的异常表达,但关于PHD2在肿瘤进展中的作用目前尚未达成共识。各种相关研究常常得出互相矛盾的结论,其既有可能通过降解HIF-1α发挥抑癌的作用,亦有可能通过其他途径促进肿瘤细胞增殖、增强其侵袭和转移的能力,从而导致肿瘤的恶性进展。PHD2在HCC中的研究报道较少,其表达情况与HCC患者预后的关系,以及可能的机制尚不十分清楚。本课题拟从以下两个部分进行研究,第一部分首先检测PHD2在HCC组织标本中的表达情况,并结合临床数据分析其与HCC患者预后的关系;第二部分通过体内、体外的实验研究PHD2对HCC生物学行为的影响并探讨可能的分子机制。以期为HCC患者提供一个评价预后的指标,为HCC的临床治疗研究提供一个潜在的靶点。第一部分:PHD2在HCC组织中的表达与患者预后的关系目的检测PHD2在HCC组织标本中的表达量,并结合临床数据分析其与HCC患者预后的关系。方法首先通过免疫组化(IHC)的方法分别对20例正常肝组织、20例HCC癌组织中PHD2表达量进行检测;再进一步检测并分析220例HCC患者组织标本中PHD2表达与HCC的临床病理特征之间的关系;随访220例HCC患者并记录每个患者的生存时间,然后对PHD2的表达量与HCC患者的预后进行统计学分析,绘制生存曲线,进行多因素回归分析,了解PHD2与HCC患者预后的关系。结果1.IHC检测发现,与正常肝组织相比,HCC中PHD2的蛋白表达量明显升高。2.采用IHC技术对220例HCC病例样本进行检测和评分,结果提示PHD2的高表达与肿瘤体积较大、分化程度较低、TNM分期较晚、高水平的甲胎蛋白(alphafetoprotein,AFP)显著相关。3.对随访资料进行统计分析发现:与PHD2低表达组HCC患者相比,PHD2高表达患者的术后无病生存时间((25.5±3.6月vs.16.7±3.4月,log-rank,P<0.001)及总生存时间(37.5±3.6月vs.29.5±4.7月,log-rank test,P<0.001)均较短,通过多因素分析发现PHD2表达水平、血清AFP水平、肿瘤大小、病理分期是影响HCC患者生存的独立预后指标。第二部分PHD2对HCC生物学行为的影响及机制探讨目的研究PHD2对HCC生物学行为的影响并探讨相关分子机制方法应用Western-blot检测3株HCC细胞(QGY7703,Bel7404,Hep3B)正常肝细胞系L02中PHD2的表达水平;利用RNA干扰技术,分别选择PHD2 si RNA和阴性对照si RNA转染三株HCC细胞,采用Western Blot技术检测HCC细胞株PHD2被沉默的效果,MTT法检测每株HCC细胞的增殖情况,transwell实验检测每株HCC细胞侵袭力和迁移力,采用流式细胞计数检测每株HCC细胞的凋亡情况,应用Hep3B细胞株,建立HCC裸鼠移植瘤模型,建立模型成功后,将实验动物进行分组,PHD2沉默组利用瘤体内注射的方式将胆固醇修饰的PHD2 RNAi注射入瘤体内,同时设立空白组(不做处理)和生理盐水对照组(注射生理盐水)进行对照研究,每4天注射一次,观察并记录裸鼠的瘤体生长变化情况,开始注射药物后第16天处死裸鼠,采集瘤体标本用Western Blot技术检测了PHD2、p-s MAD2/3及癌基因c-myc的表达情况;采用IHC技术检测220例HCC临床标本中c-Myc的表达,分析其与PHD2以及HCC患者临床病理特征的相关性,结果1体外细胞实验结果证明,与正常肝细胞株相比,癌细胞株PHD2的表达明显升高。采用PHD2 RNAi干扰后,与阴性对照si RNA组相比,三个HCC细胞株的增殖(P<0.05)、侵袭力与迁移力都有显著性下降(P<0.05),凋亡增加(P<0.05)。2在HCC裸鼠移植瘤模型中PHD2沉默组裸鼠瘤体增长缓慢(P<0.05)。瘤体标本中PHD2沉默组p-SMAD2/3表达水平明显高于空白组和对照组(P<0.05),而PHD2沉默组c-Myc的表达水平明显低于其他两组(P<0.05)。3 IHC术检测220例HCC临床标本中c-Myc的表达,c-Myc的高表达与肿瘤体积较大、分化程度较低、TNM分期较晚、高水平的甲胎蛋白显著相关,与PHD2的表达也显著相关(r=0.557,P<0.001)结论1、PHD2的高表达与HCC患者较差的预后密切相关。2、HCC细胞株中PHD2表达增高;PHD2的高表达可以促进HCC细胞的增殖、迁移、侵袭,减少细胞的凋亡;PHD2促进HCC进展的作用有可能是通过抑制TGF-β1-smad信号通路中的p-SMAD2/3表达,进而上调癌基因c-myc的表达来实现的。