背景与目的新生儿缺氧缺血性脑病(Hypoxic-Ischemic Encephalopathy, HIE)是围生期窒息后的主要并发症之一,中、重度HIE幸存者中有25%将出现永久性的神经功能障碍,是脑性瘫痪的主要病因。由于新生儿缺氧缺血性脑病发病机制复杂,目前,国内外尚没有公认的特效的治疗方法,许多神经保护治疗方法都处于探索阶段,寻找更为有效的治疗HIE方法仍然是围产医学的重要课题之一。HIE损伤从开始一直延续到复苏后的再灌注期间,其发病机制包括脑血流量失调、无氧代谢增加、ATP减少、低血糖、高乳酸血症、兴奋性氨基酸增加、细胞内钙离子聚集、一氧化氮合成的激活、氧自由基及炎症因子的产生、神经元迟发型死亡(凋亡)等,这些发病机制是研发脑损伤后神经保护疗法的基础。近年来,国内外研究发现环磷腺苷(Cyclic Adenosine-3’5’-monophosphata, cAMP)参与了多种神经系统疾病的发病机制,在神经系统损伤修复中也占有重要的地位。cAMP是细胞内传递激素和递质的中介因子,因此也被称为“第二信使”。细胞内cAMP由ATP经腺苷酸环化酶(AC)催化而成,由磷酸二酯酶(PDE)水解而降解,由此保持细胞内cAMP水平的稳定性。研究表明cAMP在神经代谢调控中起重要作用,细胞内cAMP浓度的改变能影响多种细胞内信号转导途径,从而调控基因表达、蛋白活性及细胞功能,对细胞的分化、生长、代谢及调亡过程发生影响。临床研究发现新生儿窒息后脑脊液中cAMP水平下降,且cAMP的水平与病情的严重程度及预后密切相关,新生动物缺氧缺血性脑损伤实验也证实这一发现,提示cAMP可能参与了新生儿缺血缺氧脑损伤的发病机制。由此可以设想,缺血缺氧损伤后及时补充外源性cAMP,或给予延缓cAMP降解的药物,提高cAMP水平,在早期阻止cAMP信号途径失调导致的瀑布效应,可能会显著地减轻缺血缺氧造成的损伤,促进损伤神经元功能的恢复。外源性cAMP:环磷腺苷在临床上已广泛用于治疗心功能不全,其安全性和有效性早已得到公认,对新生儿窒息后心肌损伤也有一定的治疗作用。二丁酰环磷腺苷(N6,2’-O-Dibutanoylcyclicadenosine 3’,5’-monophosphate sodium salt, db-cAMP)也叫双丁环腺苷钠,是环磷腺苷的新型衍生物,作用和用途与环磷腺苷相同,在所有cAMP类似物中膜渗透性最强,可直接增加细胞内cAMP含量。研究发现db-cAMP能增强心肌收缩力,降低血管阻力,改善外周循环,促进胰岛素分泌,促进组织摄入糖等。近年来研究发现db-cAMP在在体和离体条件下都能直接促进神经生长,db-cAMP能否改善新生儿缺血缺氧性脑损伤少有报道。磷酸二酯酶(PDE)抑制剂：氨茶碱为黄嘌呤类药物,为茶碱与乙二胺复盐,为非选择性磷酸二酯酶(PDE)抑制剂,包括抑制主要水解cAMP的PDE3、PDE4,使细胞内cAMP水平升高。氨茶碱除有强心利尿、抗炎、免疫调节,兴奋呼吸中枢等作用外,氨茶碱还可以减缓成人及低体重新生儿的脑血流速度,改善缺血后脑水肿和脑损伤以及降低实验性脑缺血大鼠的死亡率。但氨茶碱对缺血缺氧性脑损伤保护作用的机理研究尚不深入。本实验拟采用大鼠嗜铬细胞瘤(PC12)细胞缺氧葡萄糖剥夺(oxygen-glucose deprivation, OGD)模型,初步探讨给予外源性新型cAMP类药物(db-cAMP)提高细胞内cAMP浓度,以及给予非选择性磷酸二酯酶(PDE)抑制剂氨茶碱减缓细胞内cAMP降解及两药联合应用对缺血缺氧神经细胞的保护作用以及可能的机制,试图为新生儿HIE的临床治疗提供新的思路与方法。研究方法1.PC12缺氧葡萄糖剥夺模型的建立：细胞培养48小时进行OGD处理：细胞吸去培养液,以无糖平衡盐缓冲液(Earle’s balanced salt solution, EBSS)轻轻冲洗两遍,并加入无糖平衡盐缓冲液,置于缺氧培养箱N2／C02／02(94%／5%／1%)条件下进行OGD损伤处理4h后,将液体换成DMEM培养液复氧24h。对照组细胞在含葡萄糖平衡盐缓冲液置于C02培养箱培养,4h后将液体换成含糖DMEM培养液。2.PC12细胞活性的检测PC12细胞OGD处理4小时并复氧24小时后,加入MTT,37℃孵育4h,去除培养液,并加入二甲基亚砜(DMSO)低速振荡,使结晶物充分溶解,酶标仪测定570nm波长的吸光度(OD值),并设置空白对照孔,细胞各孔吸光度减去空白对照孔的吸光度即为PC12细胞产生吸光度。细胞吸光度可直接反应细胞活性。每组设6个复孔。3.MTT法筛选氨茶碱和db-cAMP单独或联合用药的最佳浓度3.1氨茶碱最佳浓度筛选：试验分为正常对照组和OGD组,OGD组分为未用药组和氨茶碱药物组,根据文献,氨茶碱药物浓度初步定为1×10-2mg/L、3×10-2mg/L.8×10-2mg/L和10×10-2mg/L浓度组。3.2 db-cAMP最佳浓度筛选：试验分为正常对照组和OGD组,OGD组分为未用药组和db-cAMP药物组,根据文献,db-cAMP药物浓度初步设定为1×10-6mol/L、1×10-5mol/L、1×10mol/L和1×10-3mol/L浓度组。3.3 db-cAMP和氨茶碱联合用药最佳浓度筛选：试验分为正常对照组和OGD组,OGD组分为未用药组和联合用药组,根据不同的药物浓度分为联合用药Ⅰ组：氨茶碱1×10-2mg/L+db-cAMP1×10-6mol/L、Ⅱ组：氨茶碱3×10-2mg/L+db-cAMP1×10-5mol/L、Ⅲ组：氨茶碱5×10-2mg/L+db-cAMP1×10-4mol/L浓度组。4.氨茶碱和db-cAMP单独或联合用药对细胞活性的影响试验分为正常对照组和OGD组,OGD组分为未用药组和药物组,根据不同药物分为氨茶碱组、db-cAMP组和两药联合用药组。细胞活性检测的方法同上。5.氨茶碱和db-cAMP单独或联合用药对细胞凋亡率的影响Hoechst33342荧光染料测定细胞凋亡,PC12细胞OGD损伤后复氧24h,弃去培养液,用PBS漂洗后加入固定液固定细胞,再用PBS液漂洗。自然干燥,加入Hoechst33342荧光染料,室温下避光染色,PBS液再漂。荧光显微镜下观察细胞核的形态并计数,被染上荧光表示细胞已经凋亡。计数细胞,细胞凋亡率用凋亡细胞数占细胞总数的百分比表示。分组同上。6.氨茶碱和db-cAMP及两药联合用药对细胞内钙离子浓度的影响PC12细胞经OGD和复氧24h后,收集细胞用D-Hanks液洗,台盼蓝染色,计数活细胞为95%以上,加入钙荧光指示剂Fura-2/AM,37℃负载。D-Hanks液洗涤后,使用双波长荧光分光光度计检测,激发光波长为340nm,发射光波长为500nm,狭缝10nm,测得样品荧光值F,再加入曲拉通-100(TritonX-100)测荧光值Fmax,加入钙离子螯合剂乙二醇-双-2-氨基乙基四乙酸(EGTA)测荧光值Fmin,按下面公式求出[Ca2+]i,Kd在37℃为224 nmol/L。分组同上。[CA2+]i(nmol/L)=Kd(F-Fmin)/Fmax-F7.氨茶碱和db-cAMP及两药联合用药对细胞内caspase-3凋亡酶活性的影响按Caspase-3活性检测试剂盒说明检测caspase-3凋亡酶活性,步骤如下(1)测定4-硝基苯胺(pNA)和总蛋白标准曲线；(2)样品收集：细胞经OGD损伤和药物处理后收集细胞,加入裂解液裂解离心,收集上清；(3)caspase-3凋亡酶活性检测：设置空白对照孔和样品孔,在37℃孵育4h,在A405酶标仪下检测,样品A405扣除空白孔A405即为样品中caspase-3催化产生的pNA产生的吸光度,通过步骤1中获得的标准曲线就可以计算出样品中催化产生的pNA的量;(4) Bradford法检测样品总蛋白浓度；(5)计算caspase-3凋亡酶活力单位。分组同上。8.MTT法检测db-cAMP对PC12细胞保护作用的时间窗用MTT方法检测细胞活性,方法同前。试验分为正常对照组和OGD组,OGD组分为未用药组和药物组,用药组根据不同加药时间分为Oh组,1h组,2h组,4h组,8h组,16h组。9.统计方法各组数据应用SPSS 13.0统计软件进行分析。实验数据采用平均数±标准误表示(×±s)表示,所有计量资料间比较在确定方差齐性后(P>0.05),各组间比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA),各组均数间的多重比较采用LSD法(Least-significant difference test)或SNK法,如果方差不齐则用Welch法,各组间多重比较采用dunnett’s T3检验。两处理组均数比较采用两样本t检验,P<0.05被认为差异具有统计学意义。结果1.建立PC12缺氧葡萄糖剥夺模型氧葡萄糖剥夺复氧后,与正常培养PC12细胞相比,OGD后PC12细胞活性下降35.71%,细胞凋亡率升高31.57%,细胞内钙离子浓度增加到286.182nmol/L(对照组细胞内钙离子浓度为121.094 nmol/L),细胞内caspase-3凋亡酶活性增高4.444单位(对照组未检测到有活性的caspase-3凋亡酶)。2.氨茶碱、db-cAMP和联合用药最佳浓度通过MTT筛选药物浓度,氨茶碱组浓度为5×10-2mg/L, db-cAMP组浓度1×10-4mol/L,联合用药组浓度氨茶碱3×10-2mg/L+db-cAMP1×10-5mol/L,分别为该药物提高细胞活性的最佳浓度。3.氨茶碱和db-cAMP单独或联合用药对细胞活性的影响氨茶碱组与未用药组比较细胞活性无显著提高,差异无统计学意义(P=0.167)：db-cAMP组和联合用药组与未用药组比较细胞的活性显著增加(P=0.001,P=0.000),显示OGD后使用db-cAMP单独和联合使用氨茶碱可提高PC12细胞活性。4.氨茶碱和db-cAMP单独或联合用药对细胞凋亡率的影响氨茶碱组与未用药组比较,细胞凋亡率无显著降低,差异无统计学意义(P=0.194)：db-cAMP组和联合用药组与未用药组比较凋亡率显著降低,差异有统计学意义(P=0.004,P=0.002),显示OGD后使用db-cAMP单独和联合使用氨茶碱可降低PC12细胞凋亡率。5. db-cAMP和联合用药能降低OGD损伤后PC12细胞内钙离子浓度氨茶碱组与未用药组比较细胞内钙离子浓度无显著降低,差异物统计学意义(P=0.751)；db-cAMP和联合用药组与未用药组比较细胞内钙离子浓度显著降低,差异有统计学意义(P=0.038,P=0.020),显示OGD后使用db-cAMP单独和联合使用氨茶碱可降低PC12细胞内钙离子浓度。6.各组药物对OGD损伤后PC12细胞中caspase-3凋亡酶活性作用不明显正常对照组细胞内未检测到有活性的caspase-3凋亡酶,OGD各组细胞内检测到有活性caspase-3凋亡酶；氨茶碱、db-cAMP和联合组与未用药组比较Caspase-3凋亡酶活性降低无明显差异(P>0.05)。显示OGD复氧后各组药物对降低细胞中caspase-3凋亡酶活性作用不明显。7. db-cAMP对PC12细胞保护作用的时间窗0h,1h,2h,4h组与未用药组比较细胞活性增高有统计学意义(P<0.05),4h及之前不同时间点给药均能提高细胞的存活率；4h内不同时间点给药组之间没有统计学差异(P>0.05)；8h和16h给药细胞活性与未用药组比较细胞活性无统计学差异(P>0.05)；16h组与4h内不同时间点给药组比较细胞活性显著降低,差异有统计学意义(P<0.05)。提示db-cAMP对缺血缺氧后PC12细胞4h内给药有保护作用。总结1.OGD损伤后给予外源性db-cAMP可显著增加细胞的活性和减少凋亡率,提示外源性db-cAMP对缺氧缺血损伤细胞有保护作用。2.氨茶碱单独用药不能显著提高细胞活性和减小凋亡率,提示缺氧缺血损伤后细胞内c-AMP呈低水平状态时,单独使用氨茶碱对缺氧缺血损伤细胞的保护作用有限。3.研究发现将较小剂量氨茶碱和较小剂量的db-cAMP联合使用能达到单独使用较大剂量db-cAMP相同的保护作用,提示在有效地提高cAMP水平的基础上,小剂量氨茶碱可发挥辅佐cAMP药物抗细胞死亡与凋亡的协同效应。4.在缺氧缺糖损伤后4h内使用db-cAMP可有效地提高细胞活性,8h后使用无明显效果,这为临床用药时机的选择,早期干预治疗提供了实验依据。5.发现钙离子内流和caspase-3凋亡酶可能参与了OGD后PC12细胞损伤机制；db-cAMP组和联合用药组可以阻止细胞内钙离子内流,但不能使caspase-3凋亡酶活性明显降低,db-cAMP抗凋亡机制还有待进一步深入研究。