第一部分金属硫蛋白MT基因的质粒构建和在细胞中的过表达分析　　目的：为研究MT基因的生物学功能,构建带FLAG标签的真核表达载体,将MT2A质粒瞬时转染至COS7细胞,观察表达的蛋白在细胞内的定位;将MT2A与CLIC1质粒共同瞬时转染至COS7细胞,观察两种蛋白在细胞内的共定位情况;将质粒分别转染至HEK293T细胞,用免疫共沉淀实验检测MT2A蛋白与CLIC1蛋白在哺乳动物细胞内的相互作用情况。构建pGEX-3X-MT2A原核表达载体,将质粒转化至BL21菌株中,IPTG诱导GST-MT2A的表达,进行GST pull-down实验检测MT2A蛋白与CLIC1蛋白在体外的相互作用。　　方法：用PCR方法,以含人MT全长cDNA序列的质粒为模板,扩增MT全长序列,酶切回收目的片段,插入到载体pGADT7、pCDNA3.1上,构建酵母表达载体pGADT7-MT,真核表达载体pCDNA3.1-MT-His6、pCDNA3.1-MT-FLAG。以同样方法构建原核表达载体pGEX-3X-MT。重组质粒经酶切鉴定正确的送测序公司测序。　　分别将pCDNA3.1-MT2A-FLAG质粒瞬时转染至COS7细胞,在荧光显微镜下观察MT2A蛋白的细胞定位;pCDNA3.1-MT2A-FLAG与pCDGFP-CLIC1共同转染至COS7细胞,荧光显微镜下观察两种蛋白在细胞内的共定位;将两组质粒共同瞬时转染至HEK293T细胞,通过免疫共沉淀实验检测MT2A蛋白与CLIC1蛋白在哺乳动物细胞内的相互作用。构建表达载体pGEX-3X-MT2A,转化大肠杆菌BL21,表达融合蛋白GST-MT2A,进行GST pull-down实验,检测MT2A蛋白与CLIC1蛋白在体外的相互作用。　　结果：酶切和测序图谱证明各载体均构建正确。在荧光显微镜下观察到,在COS7细胞中,MT2A蛋白主要分布在细胞质中。共定位实验观察到MT2A蛋白与CLIC1蛋白无明显共定位。免疫共沉淀实验表明,在HEK293T细胞中,MT2A蛋白与CLIC1蛋白在细胞内不存在相互作用。GST pull-down实验表明MT2A蛋白和CLIC1蛋白在体外无相互结合。　　结论：在COS7细胞中,MT2A蛋白与CLIC1蛋白无明显共定位;免疫共沉淀实验证明在HEK293T细胞中,MT2A与CLIC1蛋白不存在相互作用;GSTpull-down实验表明MT2A蛋白和CLIC1蛋白在体外无相互结合。　　第二部分肌营养不良蛋白聚糖DG与Sedlin相互作用的初步研究　　目的：为研究DG蛋白与Sedlin的相互作用,构建带FLAG标签的DAG1真核表达载体,将质粒瞬时转染至COS7细胞,观察表达的蛋白在细胞内的定位;将DAG1与Sedlin质粒共同转染至COS7细胞,观察两种蛋白在细胞内的共定位情况。　　方法：用PCR方法,以含人DAG1全长cDNA序列的质粒为模板,扩增DAG1全长序列,酶切回收目的片段,插入到载体pCDNA3.1上,构建真核表达载体pCDNA3.1-DAG1-FLAG。将pCDNA3.1-DAG1-FLAG质粒瞬时转染至COS7细胞,在荧光显微镜下观察DG蛋白的细胞定位。pCDNA3.1-DAG1-FLAG与pCDGFP-Sedlin共同转染至COS7细胞,荧光显微镜下观察两种蛋白在细胞内的共定位。　　结果：酶切和测序图谱证明载体构建正确。在荧光显微镜下观察到,在COS7细胞中,DG蛋白在细胞质和细胞核内均有分布,尤其在细胞膜上分布更集中。与Sedlin真核表达载体共同转染入COS7细胞后,DG蛋白在细胞中的分布出现向细胞核附近集中的趋势。　　结论：在COS7细胞中,DG蛋白在细胞质和细胞核内均有分布,尤其在细胞膜上分布更集中。与Sedlin真核表达载体共同转染入COS7细胞后,DG蛋白在细胞中的分布出现向细胞核附近集中的趋势。