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目的:肿瘤代谢重编程是包括前列腺癌(PCa)在内的许多类型肿瘤的共同特征。肿瘤脂质代谢不仅可以为肿瘤细胞的分裂和快速生长提供充足的脂质,而且还是形成新细胞膜的关键来源,并且还能增强肿瘤的信号通路。磷脂酰肌醇特异性磷脂酶Cε(PLCε)作为一个致癌基因,可以推动肿瘤的增殖,侵袭,转移和脂质代谢,但其在PCa脂质代谢中的具体作用尚不完全清楚。本研究的目的是筛选一些与PCa脂质代谢相关的诊断性血液学生物标志物以及探索PLCε在PCa脂质代谢和增殖中的分子作用机制。方法:(1)收集2018年8月到2019年8月在重庆医科大学附属第一医院泌尿外科住院治疗的60例PCa患者手术前空腹血清标本及健康管理中心体检的30例正常的健康成年男性空腹血清标本。并及时制成干滤纸血片储存于4°C干燥环境中备用。最后利用液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)技术对PCa患者及健康体检者血清中脂质代谢产物(脂酰肉碱)的含量进行分析,并通过受试者工作曲线(ROC)及曲线下面积(AUC)判断已筛选出的部分脂酰肉碱作为PCa诊断标志物的可行性。(2)收集2015年3月到2019年8月在重庆医科大学第一附属医院泌尿外科住院治疗的60例PCa患者和60例前列腺增生患者的术后组织病理标本。通过免疫组织化学法(IHC)检测PLCε和AMPK/SREBP-1信号通路中相关因子的蛋白表达情况,同时利用Spearman’s相关性分析揭示PLCε与SREBP-1、FASN之间的表达相关性,利用Kaplan?Meier生存曲线分析比较两者(High-PLCε、Low-PLCε)之间的无进展生存期(PFS),最后回顾性分析PLCε表达与PCa患者的临床病理特征参数之间的关系。(3)在细胞水平,首先通过尼罗红染色和油红O染色比较PCa细胞(PC3、LNCaP)与人正常前列腺上皮细胞(RWPE-1)中脂滴含量,同时利用Western blot与RT-qPCR比较RWPE-1与PCa细胞中脂代谢相关因子的表达。接着利用搭载干扰PLCε的慢病毒短发夹RNA(LV-shPLCε#1/#2/#3)及搭载空载慢病毒(即阴性对照慢病毒)短发夹RNA(LV-shNC)转染LNCaP和PC3细胞,并通过后续的筛选、验证得到稳定转染敲低PLCε慢病毒(LV-shPLCε)及空载慢病毒(LV-shNC)的PCa细胞株。待成功构建shPLCε细胞株后,提取PCa细胞的蛋白及mRNA,检测下游与代谢及增殖相关的因子的表达,同时检测shPLCε后PCa细胞的脂滴含量变化情况,及利用Ki-67染色及克隆形成实验检测shPLCε后PCa细胞的增殖情况。(4)为进一步探讨PLCε调控PCa脂代谢的分子机制,首先选择shPLCε后的PC3、LNCaP细胞系,通过细胞免疫荧光检测两株细胞中SREBP-1的蛋白分布情况。接着分别提取两株细胞的核蛋白及浆蛋白,利用Western blot分析SREBP-1在胞核及胞浆中的表达。然后在两株细胞中,分别设置阴性对照组(NC),shPLCε组,shPLCε+AMPK抑制剂(Dorsomorphin)组及NC+Dorsomorphin组,提取处理后细胞总蛋白,Western blot分析total-AMPKα、p-AMPKα及SREBP-1蛋白变化,尼罗红染色测试PCa细胞的脂代谢变化,Ki-67荧光染色、克隆形成实验检测PCa细胞的增殖变化情况。(5)体内实验,将六周龄大小的裸鼠分成两组(NC组和shPLCε组),每组5只,将PC3+NC慢病毒细胞和PC3+shPLCε慢病毒细胞分别注入各组中的裸鼠右侧翼背部皮下(每只注入2x10~6个细胞)。每周测量肿瘤的重量及体积。6周后处死裸鼠,将肿瘤组织样本取出、测量其体积及重量,最后利用IHC检测两组肿瘤组织中相关蛋白表达的差异情况。结果:(1)LC-MS/MS检测结果显示,在PCa患者血清30多种酰基肉碱中,C0、C2、C4DC、C5、C5DC、C5OH、C8、C8:1、C10、C10:1、C12、C16的水平均高于正常对照组。其中,再进一步通过ROC曲线分析揭示,C0、C5、C5DC、C5OH、C8、C8:1、C10、C10:1、C12可能成为潜在的诊断PCa的血液学生物标志物并用于PCa的筛查。(2)IHC检测显示PLCε、SREBP-1及FASN在PCa组织中的表达高于BPH组织样本。Spearman’s相关性分析揭示PLCε与SREBP-1,PLCε与FASN之间呈正相关性。通过对PCa患者的临床病理参数分析发现,PLCε高表达与患者的组织学分期、骨和内脏转移呈正相关。Kaplan-Meier生存分析显示,与低表达PLCε的患者(中位PFS:29个月)相比,高表达PLCε的患者(中位PFS:23个月)的无进展生存期更短。(3)尼罗红和油红O染色结果显示,PCa细胞(PC3、LNCaP)中的脂滴含量比RWPE-1细胞高。Western blot与RT-qPCR结果显示,在PC3和LNCaP中的PLCε、SREBP-1和FASN的蛋白及mRNA表达水平较RWPE-1细胞升高。慢病毒转染PC3和LNCaP细胞结果显示,与阴性对照组相比,在两株细胞中干扰PLCε的慢病毒短发夹RNA3(Lv-sh-PLCε#3)能显著地降低PLCε的蛋白质及mRNA水平。利用成功构建的shPLCε细胞株进行后续实验,结果显示,当敲低PLCε后,下调了与脂代谢相关因子(SREBP-1、FASN、ACACA、ACLY、SCD1)及增殖相关因子(PCNA、Cyclin D1)的蛋白及mRNA表达水平下调,同时降低了PC3和LNCaP细胞中的脂滴含量。Ki-67荧光、克隆形成和CCK-8实验分析还表明,敲低PLCε后,PCa细胞的增殖能力显著下降。(4)免疫荧光检测结果表明,在PC3和LNCaP细胞中沉默PLCε可以显著减少SREBP-1在细胞核中的分布。Western blot分析两株细胞核、浆蛋白结果显示,沉默PLCε可以显著下调SREBP-1在细胞核中表达,而胞浆中的表达无明显改变。有趣的是,当沉默PLCε后,能上调磷酸化的AMPK(p-AMPK)蛋白水平,而总的AMPK(total-AMPK)无明显变化。但在沉默PLCε同时当加入Dorsomorphin(抑制AMPK磷酸化)后,p-AMPK和SREBP-1的蛋白表达得到了逆转。后续脂代谢功能试验(尼罗红染色)和细胞增殖试验(Ki-67荧光和克隆形成)均得到相同的结果。(5)体内实验,裸鼠肿瘤组织的IHC结果显示,与对照组相比,敲低PLCε后PLCε、SREBP-1的表达水平下降,p-AMPK表达升高,Ki-67染色的阳性细胞率降低。与此同时,沉默PLCε后裸鼠皮下肿瘤的重量明显减轻、体积也减小。结论:本研究表明,部分脂质酰基肉碱可能成为潜在的诊断PCa的血液学生物标志物。高表达的PLCε可能预示PCa较短的PFS,并和PCa的组织学分期、骨和内脏转移相关。此外,我们发现PLCε/AMPK/SREBP-1信号通路在体内和体外通过调节脂质代谢驱动PCa的进展。总之,为更深入地理解PCa的发生与发展,我们的研究揭示了PLCε在PCa的脂质代谢和恶性增殖行为中的重要作用。