论文部分内容阅读
研究背景和目的寨卡病毒病是一种由寨卡病毒(Zika Virus)引起、蚊媒传播的急性自限性疾病。在感染者中,大约有20%的患者会表现出轻微的临床症状,典型的症状包括急性发作的低热、关节痛(主要是手、足小关节)、斑丘疹、结膜炎等,其他的症状还包括肌肉痛、眼眶痛、头痛和无力等。尽管感染寨卡病毒患者的症状较为温和,但其隐性感染率很高,且可引起胎儿和婴儿小头畸形和格林—巴利综合征等严重并发症。鉴于目前寨卡病毒传播方式蚊媒的广泛分布、缺少疫苗及快速可靠的病毒检测方法、新传播国家的人群对病毒缺乏免疫力等,寨卡病毒已经成为全球关注的公共卫生问题,治疗寨卡病毒病和预防寨卡病毒疫情是当前非常紧迫的任务之一。寨卡病毒的特效药和疫苗已成为当前预防寨卡病毒疫情的热点研究。新近研究发现寨卡病毒能够持续感染主要组成大脑皮层血脑屏障的人脑微血管内皮细胞(Human Brain Microvascular Endothelial Cell,HBMEC)进而感染脑组织,引起脑炎和胎儿脑垂体病等严重的脑组织损伤。同时有研究证明荜茇酰胺(Piperlongumine,PL)可以通过抑制一些炎症来保护脑组织。因此本课题组主要研究PL是否可以抑制寨卡病毒的复制、增殖及其作用的机制。从而为临床寨卡病毒病的药物治疗研究提供新的思路线索。研究方法1.PL对寨卡病毒吸附和复制的影响寨卡病毒在Vero细胞中扩增和滴度测定后,感染HBMEC、HUVEC和Vero细胞。不同浓度的PL作用于感染病毒后的细胞,应用荧光定量PCR(Real Time-PCR,RT-PCR)、TCID50(Tissue culture infective dose50)技术分别检测病毒在细胞内的复制情况、细胞上清中的含量,确定PL对寨卡病毒复制的影响。2.PL对HO-1表达的影响PL作用于感染寨卡病毒的细胞后,运用RT-PCR技术和蛋白免疫印迹(Western Blot)技术对细胞中HO-1的表达量进行检测。比较不同时间及不同浓度的PL对HO-1表达量的影响。应用N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)清除ROS,然后检测HO-1的表达量和寨卡病毒量。3.HO-1对寨卡病毒复制的影响运用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术对HO-1进行沉默干扰后,检测HO-1的表达量,确证干扰后HO-1表达量减少。然后应用RT-qPCR技术对寨卡病毒的复制增殖量进行检测,明确病毒复制与HO-1表达之间的关系。结果(1)寨卡病毒可以在HBMEC、HUVEC中扩增,与新近的报道结果一致。尤其是ZIKV可以感染HBMEC,为ZIKV导致神经系统感染解释了跨越血脑屏障的途径。(2)PL对HBMEC、HUVEC和Vero细胞有微弱的毒性,对ZIKV具有明显的抑制增殖的作用,具有时间和浓度依赖作用。这种抑制作用不影响病毒对细胞的粘附,主要是通过抑制病毒在细胞内的复制作用。(3)PL在mRNA和蛋白质水平上具有诱导HO-1表达增加的作用。(4)PL诱导HO-1表达增加,与ROS增加密切相关。当应用NAC清除ROS后,HO-1表达下调。而与Nrf2的表达无关,在PL处理细胞后,Nrf2表达无明显变化。(5)PL抑制ZIKV的复制与ROS增加密切相关。当应用NAC清除ROS后,ZIKV复制得到部分恢复。(6)初步实验结果提示HO-1的表达对病毒的复制具有抑制作用。结论PL通过诱导细胞ROS增加,进而增加HO-1的表达,最终达到抑制ZIKV在细胞中复制的作用。通过本文的研究,为临床寨卡病毒病的药物治疗研究提供新的思路线索。