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番茄病害是目前导致番茄产量严重下降的主要原因,并给番茄产业带来巨大的经济损失。2013-2014年,本课题组调查番茄病害时,在我国大连地区商业温室种植番茄基地发现一种病原菌侵染番茄植株引起番茄叶斑病。该病害具有侵染速度快和死亡率高的特点,严重影响该地区番茄的产量和质量。对引起番茄叶斑病的病原菌进行分离和鉴定,并对该病原菌侵染番茄植株的入侵途径和致病分子调控机制的研究是控制该病害的重要前提。因此,本论文围绕以上科学问题开展研究,主要研究结果和结论如下:(1)发现层出镰孢菌可侵染番茄植株引起番茄叶斑病。在大连地区采集番茄叶斑病病叶,对病原菌分离纯化,科赫氏法则验证,并通过形态学、细胞学和分子生物学等方法对病原菌进行鉴定。表明层出镰孢菌是引起番茄叶斑病的新病原菌,其分类地位为真菌界(Fungi),子囊菌门(Ascomycota),盘菌亚门(Pezizomycotina),粪壳菌纲(Sordariomycetes),肉座菌目(Hypocreomycetidae),丛赤壳科(Nectriaceae),镰孢菌属(Fusarium),藤仓赤霉菌交配群D(Gibberella fujikuroi D),层出镰孢菌(Fusarium proliferatum(matsush.)Nirenberg),命名该菌株为层出镰孢菌 K140108。(2)层出镰孢菌K140108是通过气孔入侵番茄叶片组织。采用扫描电镜对层出镰孢菌K140108与番茄叶片互作的不同阶段进行观察。结果表明,层出镰孢菌K140108与番茄叶片互作12小时,叶片表皮细胞发生不规则褶皱;互作48小时,观察到分生孢子进入叶片气孔;互作72小时,大多数气孔填满分生孢子;互作96小时,分生孢子布满叶片组织,有菌丝从气孔中长出,叶片上出现褐色水渍斑点。(3)层出镰孢菌K140108与番茄叶片互作转录组分析。利用RNA-seq技术对层出镰孢菌K140108侵染96小时的番茄病叶进行转录组测序分析,并以菌株K140108作为对照组。共获得61,544,598个clean reads用于denovo组装层出镰孢菌K140108参考转录组。基因功能注释分析后,得到75,044个Unigenes,其中19.46%Unigenes被分配到276个KEGG代谢通路,其中22.30%的Unigenes与水稻恶苗病菌(Fusarium fujikuroi)具有同源性。共鉴定出18,075个表达差异基因,通过生物信息学软件预测到720个外泌蛋白并从中筛选出184个候选效应分子,其中79.89%候选效应分子在互作96小时呈上调表达。(4)对互作96小时显著上调表达的五个效应分子进行功能研究,结果表明,它们与层出镰孢菌K140108的致病性不相关。对层出镰孢菌K140108原生质体的制备条件进行优化后,采用Split-PCR方法分别对五个效应分子(DN263、DN7752、DN12525、DN20100和DN18029)进行基因敲除。结果表明,与野生型相比,△dn7752和△dn12525突变体的菌丝紧贴培养基表面生长,△dn7752突变体产生明显的紫色色素,△dn263、△dn20100和Adn18029突变体的表型均无明显变化。番茄叶片侵染试验证明,五个突变体对菌株的致病力无明显影响。(5)层出镰孢菌K140108丝裂原活化蛋白激酶基因FpPMK1对该菌的菌丝生长和致病性具有显著调控作用。以禾谷镰孢菌直系同源的MAKR基因GPMK1编码的蛋白为靶序列,在转录组表达差异基因中获得与其相似度为99%的同源基因DN56288,将其命名为FpPMk1。敲除基因FpPMK1,获得的△Fppmk1突变体与野生型相比气生菌丝变短,生长速率和分生孢子产量明显降低。番茄叶片侵染试验证明,△Fppmk1突变体致病性显著降低。回复试验表明,FpPMK1基因回补菌株在菌落形态、生长速率、产孢量和致病力等方面都恢复到野生型状态。