海洋覆盖了超过71%的地表面积,是地球上最重要的生态系统之一。海洋中蕴藏着数量巨大、种类繁多的微生物,是开发新能源的巨大宝库。全球海洋氮源中约有25%都埋藏在深海沉积物里,因此,由沉积物细菌胞外酶所介导的有机氮的降解和转化对全球生物化学循环产生着重大的影响。深海中的高分子量有机氮几乎全都是能抵抗化学水解和生物降解的氨基化合物,胶原蛋白在高等动物(包括海洋动物)体内含量非常丰富。由于它结构复杂而致密,很难被除胶原蛋白酶以外的其他蛋白酶降解,因此很可能是深海颗粒有机氮(PON)的重要组成成分。目前研究最多的胶原蛋白酶为哺乳动物的基质金属蛋白酶(MMPs),关于细菌胶原蛋白酶的研究多来自陆地致病菌。由于对海洋蛋白酶缺乏研究,海洋中的胶原蛋白是如何被降解的还不清楚。因此,研究深海胶原蛋白酶的作用机制对于最终揭示全球海洋氮循环机制具有重要意义。深海沉积物适冷菌Pseudoalteromonas sp. SM9913分泌的蛋白酶deseasinMCP-01属于丝氨酸蛋白酶S8家族,成熟的MCP-01包含催化结构域(CATD)、连接区域、P结构域和多囊性肾病(PKD)结构域四部分,是一个多结构域的subtilisin家族蛋白酶。MCP-01成熟酶和单独的CATD均可对胶原蛋白产生降解,C端的PKD结构域能吸附并膨胀胶原蛋白,但不破坏胶原蛋白三螺旋的结构。在前期工作的基础上,本论文着重从MCP-01催化结构域的晶体结构及其对胶原蛋白的结合和降解机制上进行了研究。Myroides profundi D25是本实验室从冲绳海槽1245米深的深海沉积物中分离、鉴定的一个新的产蛋白酶菌株。该菌能分泌一种M12家族的新型弹性蛋白酶myroilysin。该蛋白酶不具有胶原蛋白酶活,但却对胶原蛋白具有显著的膨胀作用,可与外源细菌胶原蛋白酶在胶原蛋白降解过程中产生协同。在本论文中,我们纯化了菌株D25分泌的一种胞外胶原蛋白酶myroicolsin,对其酶学性质、基因序列、结构域功能及胶原蛋白降解机制进行了研究；我们还探究了菌株D25分泌的弹性蛋白酶myroilysin和胶原蛋白酶myroicolsin在降解胶原蛋白中的协同作用,并对myroilysin的发酵产酶条件进行了优化。共取得了如下研究结果：(1)蛋白酶deseasin MCP-01催化结构域识别和降解胶原蛋白的分子机制研究为了分析MCP-01识别和降解胶原蛋白的机制,我们首先利用原子力显微镜观察了MCP-01全酶、催化结构域CATD和PKD结构域对胶原蛋白纤维的作用过程,并利用生化实验进行了证实。结果表明,MCP-01和CATD都能通过降解胶原纤维之间的蛋白聚糖和原纤维内部的端肽来破坏胶原纤维复杂而致密的结构,直至释放出胶原蛋白单体,并最终将单体降解为小肽和游离的氨基酸。为了从分子层面揭示蛋白酶MCP-01识别和降解胶原蛋白的机制,我们解析了CATD的晶体结构。Carlsberg是subtilisin家族的原型酶,我们发现CATD的拓扑结构与Carlsberg非常相似,但是Carlsberg却不能降解胶原蛋白。通过生化分析及突变实验验证,我们发现CATD中由三条loop (loop7,9,11)参与围成的较大的底物结合口袋是MCP-01识别和结合大分子量底物(如胶原蛋白)所必需的；同时,这三条loop上含有的大量的芳香族氨基酸和酸性氨基酸能够形成一个带负电的疏水环境,有利于CATD与表面带正电且具疏水性的胶原蛋白的结合。利用液质联用技术分析了CATD在胶原蛋白肽链上的酶切位点。我们发现CATD在胶原蛋白肽链上的酶切位点特异性不是非常严格,它的P1位通常是Pro,而P1’位常是Gly,这可能与胶原蛋白肽链独特的氨基酸组成有关；此外碱性氨基酸残基(Lys, Arg)也多次出现在P1位上,这与本实验室前期实验结果相符,同时也是CATD不同于其它S8家族蛋白酶的地方。结构分析和突变实验证明,位于S1底物结合口袋中的His211是影响MCP-01对P1位碱性氨基酸偏好性的关键位点。综上所述,我们的研究结果揭示了S8家族丝氨酸胶原蛋白酶MCP-01识别和降解胶原蛋白的分子机制。由于目前有很多环境微生物和致病微生物都能分泌S8家族胶原蛋白酶,因此我们的结果不仅有助于研究环境中有机氮的降解机制,也为开发以S8家族胶原蛋白酶为致病因子的疾病的治疗药物奠定一定的基础。此外,由于deseasins类蛋白酶在海洋沉积物中广泛存在,我们的研究将为阐明这类蛋白酶在深海PON降解过程中的作用机制奠定基础。(2)蛋白酶myroicolsin的分离纯化、基因克隆及其酶学性质和结构域功能的研究通过硫酸铵沉淀、阴离子交换层析及分子筛层析等步骤,从菌株D25的胞外发酵液中纯化得到电泳纯的蛋白酶myroicolsin。Myroicolsin对胶原蛋白的底物特异性非常广泛,可以降解多种天然胶原蛋白(Ⅰ型、Ⅱ型及Ⅳ型)及明胶,其中对鱼不可溶胶原蛋白的活性最为显著。以牛不可溶Ⅰ型胶原蛋白作为底物,其最适酶活温度为60℃,在0℃下仍保持了近10%的活力；最适pH为8.5,在pH7.0-9.5的缓冲体系中可保持60%以上的酶活；同时myroicolsin对NaCl具有较好的耐受性,在0.5M NaCl中活性最高,在4M NaCl中可保持50%以上的活性,这些性质充分体现了蛋白酶myroicolsin对深海低温、弱碱和高盐环境的适应,说明该蛋白酶很可能在深海PON的降解中发挥着作用。Ca2+能显著增强myroicolsin的酶活力,而抑制剂PMSF可强烈抑制myroicolsin的酶活,推测该蛋白酶属于丝氨酸蛋白酶家族。根据成熟酶的N端氨基酸序列及丝氨酸蛋白酶家族的保守区,我们利用PCR及Tail-PCR的方法克隆了蛋白酶myroicolsin的全基因序列共2040bp,该基因编码一个包含679个氨基酸残基的蛋白酶前体,该基因序列已提交GenBankTM,序列号为JF514144。序列比对表明myroicolsin属于蛋白酶S8家族subtilisin亚家族,该蛋白酶序列新颖,与该家族中已有报道的蛋白酶相似性均低于30%,很可能是该家族中的新成员。Myroicolsin是一个多结构域的蛋白酶,其前体形式主要包含信号肽、N端前导肽、催化结构域、连接区域、β折叠结构域及C端前导肽。根据成熟酶N端序列及分子量大小,我们推测信号肽、N端前导肽及C端前导肽在myroicolsin成熟过程中自然脱落,成熟后的myroicolsin仅包括催化结构域、连接区及β折叠结构域,共计507个氨基酸残基。缺失突变的实验结果表明：myroicolsin的C端前导肽与N端前导肽的切除有关,它影响着蛋白酶的成熟但与蛋白的折叠和分泌无关；具有柔性的连接区可能与蛋白的正确折叠息息相关；而p折叠结构域在蛋白的折叠、分泌和成熟过程中均未发现有明显作用。通过底物吸附实验发现,β折叠结构域在0℃及25℃对不可溶胶原蛋白均无明显的吸附作用,这与其他胶原蛋白酶多在C端含有一个胶原蛋白结合结构域来协助催化结构域对底物进行降解有所不同,预示着myroicolsin可能有不同于其他胶原蛋白酶的独特的胶原蛋白降解机制。(3)蛋白酶myroicolsin对胶原蛋白降解机制的研究我们利用扫描电子显微镜和原子力显微镜观察发现nyroicolsin能破坏胶原纤维的结构,暴露出胶原原纤维并最终释放出胶原蛋白单体。同时结合一系列的生化实验证明了myroicolsin通过降解胶原纤维之间或胶原原纤维内部的蛋白聚糖和端肽交联而实现其对胶原蛋白的逐步降解。圆二色光谱扫描结果证明myroicolsin能破坏胶原蛋白的三螺旋结构,从中释放出a肽链,并将其降解为小肽和游离的氨基酸。通过液质联用技术分析,得到myroicolsin在胶原蛋白肽链上的酶切位点,我们发现myroicolsin对天然胶原和热变性胶原的酶切方式不同：对天然胶原蛋白,酶切位点的P1位大多数是Gly、Arg、Pro或Phe等,而P1’位主要是Gly；对热变性的胶原蛋白P1位则全被碱性氨基酸(Arg和Lys)占据,而P1’位仍然大多数都是Gly。根据以往报道,S8家族subtilisin-like蛋白酶通常偏好于降解P1位是疏水性氨基酸的肽段,而S1家族trypsin-like的丝氨酸蛋白酶通常降解P1位是碱性氨基酸的肽键,myroicolsin同时表现出subtilisin-like和trypsin-like的酶切位点特异性,同家族的细菌胶原蛋白酶MCP-01也具有这种特性,这可能是该家族胶原蛋白酶的共同之处。(4)S8家族细菌胶原蛋白酶降解胶原蛋白的机制模型蛋白酶MCP-01和myroicolsin都是由深海沉积物细菌分泌的S8家族胶原蛋白酶,两者对胶原蛋白的降解机制有一定的相似性：它们都能通过降解胶原纤维之间的蛋白聚糖而打散胶原蛋白致密的纤维状结构,暴露出大量的胶原原纤维；进而通过降解胶原原纤维内部的端肽,释放吡啶交联,加速了胶原纤维结构的瓦解,释放出大量的胶原蛋白单体；然后通过降解胶原蛋白单体内维系三螺旋稳定性的关键氨基酸周围的肽键,破坏其三螺旋结构,释放α肽链并最终将其降解为小肽和游离的氨基酸。基于蛋白酶MCP-01和myroicolsin对胶原蛋白的降解机制,提出了S8家族细菌胶原蛋白酶对胶原蛋白降解的机制模型,这让我们对深海细菌分泌的S8家族胶原蛋白酶的底物降解机制以及细菌胞外蛋白酶如何参与深海氮循环的过程有了新的认识和理解,也为新型蛋白酶资源的开发、利用奠定了重要的理论基础。(5)弹性蛋白酶myroilysin对蛋白酶myroicolsin降解胶原蛋白的协同作用研究及其中试发酵工艺本实验室前期工作发现菌株D25分泌的新型弹性蛋白酶myroilysin不具有胶原蛋白酶活性,但是却能显著的膨胀胶原蛋白,与外源胶原蛋白酶在胶原蛋白降解过程中能产生协同。本论文进一步研究了菌株D25自身分泌的弹性蛋白酶myroilysin和胶原蛋白酶myroicolsin在胶原蛋白降解中的协同作用,结果表明,myroilysin与myroicolsin确实在胶原蛋白降解过程中产生了协同,提高了myroicolsin对胶原蛋白的降解效率,这说明深海沉积物中细菌分泌的不同蛋白酶可能具有协同降解PON的生态学作用。由于胶原蛋白在生物医学领域具有广泛的用途,myroilysin膨胀却不降解胶原蛋白的特性预示着该酶可能是一种优良的胶原蛋白改性剂。因此我们采用单因子实验法分析了影响蛋白酶myroilysin产量的关键因素,得出在摇瓶中发酵的最佳培养条件：4%麸皮,2%豆粕,1%t米粉,0.4%Na2HPO4,0.03%KH2PO4,0.1%CaCl2,pH8.0,装液量100mL/500mL三角瓶,1%接种量,于15℃,200rpm培养72-84h。根据摇瓶优化的结果,进行5L发酵罐小试和200L发酵罐的中试培养,通过对发酵过程中关键参数的优化,确定了蛋白酶myroilysin的小试和中试发酵工艺,使产酶量达到1100U/mL以上,为工业发酵生产myroilysin和开发其在生物医学领域的应用潜力奠定了基础。