神经祖细胞(Neural Progenitor Cell,NPC)移植结合电刺激技术是一种非常具有应用前景的神经退行性疾病治疗策略,而在细胞移植过程中存在的细胞流动和细胞存活率低等问题可以通过三维细胞支架的使用得到有效解决。拥有良好导电性和生物相容性的三维石墨烯支架可以增加神经细胞的电活动,促进神经干细胞向神经元分化以及神经突起的延长,有望作为NPC支架应用在细胞移植中。然而,三维支架内的NPC分化形成的神经元趋向于沿着骨架生长,难以跨越孔隙形成密集的神经网络,而且目前关于三维支架的骨架尺寸变化对NPC影响的研究还非常少。本论文主要介绍一种依托微纳加工技术制备的可在亚微米级控制尺寸的三维复合石墨烯支架(Three-Dimensional Hybrid Graphene,3D-HG),支架内的二维石墨烯薄膜可以为神经突起跨孔隙连接提供支撑。研究了3D-HG的复合结构对支架内NPC分化形成神经网络的影响,并利用3D-HG研究了骨架宽度对NPC的尺寸效应,同时通过无线电刺激促进NPC分化来源的神经元突起进一步延长。论文的主要内容分为以下几个方面:(1)3D-HG的制备及其生物学效应:利用磁控溅射、紫外光刻、电镀、等离子刻蚀等微纳加工技术制备出骨架宽度、长度、高度、间隙和形状完全精确可控的三维镍支架,高温键合铜箔后形成铜镍复合催化剂,化学气相沉积生长石墨烯后湿法腐蚀掉铜和镍,形成底部为二维石墨烯薄膜的3D-HG。实验表明3D-HG拥有良好的导电性和生物相容性;当对3D-HG施加电信号时,其内NPC的钙信号活动发生急剧变化,表明3D-HG在作为细胞支架的同时可有效传递外界电信号以影响细胞行为;分化7天后的NPC在3D-HG内形成了跨越多个孔隙的神经网络;此外,扫描电子显微镜结果表明神经细胞的突起可穿透底部二维石墨烯薄膜与支架外的细胞形成连接;NPC分化14天后,免疫荧光实验、Western实验和RT-qPCR实验结果都表明3D-HG内二维石墨烯薄膜的存在明显促进了突触蛋白的表达,有利于神经网络的形成。(2)三维支架内骨架宽度对NPC的尺寸效应:制备具有不同骨架宽度的3D-HG,研究骨架宽度的变化对NPC行为的影响。NPC增殖7天后,EdU细胞增殖检测和WST-1细胞增殖实验结果都表明在骨架宽度大于胞体时,骨架宽度的变化并不会显著影响NPC的增殖。免疫荧光实验结果表明NPC分化7天后,星形胶质细胞分化比例没有显著变化,然而,随着骨架宽度变小,分化形成的星形胶质细胞有更多的突起。同时,免疫荧光实验和RT-qPCR实验结果都表明支架宽度越小,NPC越倾向于向神经元分化。(3)无线感应电刺激对NPC分化行为的影响:利用化学气相沉积法制备石墨烯线圈,当对培养皿外的导电线圈通交流电后,培养皿内的石墨烯圆环由于磁场的变化产生感应电流,感应电流的大小和频率可通过调节外部线圈的电流和频率进行有效控制。利用感应电流刺激石墨烯基底上的NPC,既发挥了石墨烯材料促进神经突起延长的优势,又结合了电刺激对神经突起生长的促进作用,使得NPC分化来源的神经元突起平均长度达296.4±18.9 μm。本研究工作通过细胞生物学、材料学与物理学的交叉应用,构建了新型石墨烯支架,实现了神经网络在三维支架内的跨间隙连接,揭示了骨架宽度和无线感应电刺激对NPC的影响,不仅为探索物理环境对细胞行为的影响提供了有力工具,也为扩展石墨烯材料在组织工程学中的应用提供了新的研究思路。