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人工血管在血管搭桥、急性血管损伤修复中具有广泛的应用价值，仅美国每年就有60万人需进行冠脉搭桥手术。冠脉搭桥需要小直径血管，用自体静脉移植其顺应性不足，用人工血管可进行冠脉搭桥，但目前直径小于6mm的人工血管移植6个月后血栓率高达40％，另外人工血管用于急性血管损伤替代治疗因来不及取病人自身的细胞种植，还必需克服同种移植排斥反应，因而如何改善移植血管的力学特性及生物相容性，防止血管闭塞，是构建小直径工程血管面临的主要问题。目前研究集中在单纯加强种子细胞的种植粘附，缺乏用基因工程方法修饰种子细胞以对抗冠脉搭桥、急性血管损伤修复前后各种致病因子对种植细胞的损伤，另外工程血管的应用面临保存问题，常规的保存方法不能很好地保留细胞活性。基于以上考虑本研究探讨用猪动脉作为小直径血管支架材料的可行性，采用生物酶法处理猪动脉，检测处理前后血管的抗原表达及力学特性是否适合作为人工血管基质材料。将A20基因应用于小直径血管构建，用RT-PCR法检测各种损伤因子作用下A20基因在内皮细胞的表达情况。采用构建成功的pEGFPEHA20-N1、pCDNA3.1EHA20真核表达载体，检测A20基因对内皮细胞的保护作用及抑制平滑肌细胞的病理性增殖情况。运用TGFβ1基因从细胞内部入手加强细胞与基质的粘附，用微管吸吮系统检测TGFβ1对血管细胞与基质材料的粘附情况。在自行设计研制的血管生物反应器中，运用已分离培养的转基因内皮细胞、平滑肌细胞，以去细胞的猪血管作为基质材料，构建新的生物人工血管。将构建的新血管用于大鼠移植，经显微外科吻合，观测移植6个月后的血管通畅情况、淋巴细胞反应及内膜增生情况，以评价基因修饰的生物人工血管的可应用性。同时运用玻璃化冻存方法对生物血管的保存进行了研究。 本研究获得以下主要结果： 1．猪血管经生物酶处理后，HE染色可见血管内细胞包括内皮细胞、平滑肌细胞及成纤维细胞已去除，血管无明显形变，胶原纤维和弹性纤维染色未见纤维断裂；血管处理后顺应性较处理前有所下降，但相差不显著。血管基质的抗原性大大下降，生物酶处理前猪异种移植排斥反应抗原α-gal表达于血管内皮细胞，在血管平滑肌细胞、成纤维细胞未见表达，western blot显示猪MHC抗原包括SLA-1及SLA-2抗原在血管有强表达，经生物酶预处理后，未见α-gal抗原、SLA-1及SLA-2抗原表达。第三军医大学博士学位论文 2.在构建了pCAGGSEHA20、pCDNA3.IEHAZo及pEGFpEHAZO一Nl真核表达载体基础上，用DOTAP脂质体将A20基因导入原代培养的内皮细胞、平滑肌细胞。通过G418筛选，免疫荧光和westem blot确定AZO基因在内皮细胞和平滑肌细胞获得稳定表达。A20基因能有效抑制氧化型低密度脂蛋白（O xLDL）诱导的内皮细胞凋亡，抑制70%以上OxLDL及低剪应力诱导的内皮细胞VCAM一1表达，同时能抑制oxLDL直接或间接诱导的平滑肌细胞表型转化、病理性增殖及凋亡。血流低剪应力能诱导内皮细胞表达vCAM一1、MCP一1，但对E一选择素表达没有影响。OxLDL能提高血流低剪应力诱导的内皮细胞VCAM一1表达。 3.AZO基因能有效抑制内毒素、缺氧、氧损伤、烧伤血清等诱导的内皮细胞活化，抑制70%以上TF、VCAM一1、ICAM一l及E一选择素等表达，同时能抑制这些创伤因素导致的内皮细胞凋亡。说明A20基因同时具有抗炎、抗血栓形成和抗凋亡的功能，能有效保护内皮细胞不受损伤。 4.DOTAP介导的pMANne0TGFpl可高效转导入原代培养的平滑肌细胞、内皮细胞。TGFpl可显著提高内皮细胞的胶原及纤维粘连蛋白表达，促进平滑肌细胞分泌弹性蛋白。微管吸吮系统检测表明TGFp，基因能显著提高内皮细胞的粘附力，较对照组提高3倍左右达806（10一，ON），显著提高平滑肌细胞的粘附力较对照组提高2.5倍达509（10一‘ON）。说明TGFp，在构建血管组织工程时可加强种子细胞种植。 5.血管细胞化需要稳定的内环境及适应受体的血流状态，为此本实验利用常用的医用硅胶管、三通装置、有机玻璃加配套的HL一4恒流泵制作了血管细胞化生物反应器，可满足在血管细胞化时加载不同的力及维持稳定的内环境。设计的各种血管接口可构建血管最小内径达o.smm。在血管生物反应器中，用原代培养的转基因人内皮细胞、平滑肌细胞种植在去细胞的猪血管基质材料上，细胞在猪血管基质材料上生长良好并合成人源性细胞外基质，成功构建了新型生物人工血管。 6.经过运用常规方法和玻璃化方法冻存血管，在冻后7d和30d，与冻存前比较，常规冻存血管细胞的存活率明显下降，内皮细胞下降最明显，玻璃化冻存在冻后7d，与冻存前比较，血管细胞的存活率明显下降，但在以后的冻存过程中基本保持稳定。冻存后3Od的血管细胞在相应的培养基中培养，观察到内皮细胞贴壁时间稍迟于新鲜对照组，但两者的形态无明显区别，能正常生长。组织块法培养平滑肌细胞一周后可见平滑肌细胞从组织块中生长，说明通过玻璃化冻存的血管全部能长出新的细胞，100%存活，且细胞活性保持良好，而常规冻存血管细胞培养仅见少量细胞生长。说明玻璃化的冻存方法可?