论文部分内容阅读
脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）和附属结构是革兰氏阴性菌的膜壁结构组成部分,这些非必需结构消耗了大量的原料和能量。本课题以大肠杆菌（Escherichia coli K-12）和恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida KT2442）为出发菌,建立了适用于基因组精简的敲除系统,构建了一系列膜壁结构精简菌株,解析了膜壁结构关键分子对细菌细胞全局影响机制,并利用一些精简菌株作为宿主生产可降解生物塑料聚羟基脂肪酸酯（PHA）。本论文主要研究结论如下:（1）通过删除LPS合成关键基因rfaD构建了大肠杆菌LPS结构精简菌株,合成最简LPS结构,即Kdo2-lipid A,并通过基因工程改造提高Kdo2-lipid A合成量。在大肠杆菌K-12菌中,通过敲除核心糖中L-D-庚糖合成关键基因rfaD,获得LPS分子结构精简菌株WJW00。通过SDS-PAGE银染,薄板层析,和电喷雾电离质谱鉴定其LPS结构为Kdo2-lipid A。WJW00合成1.31μM（2.94μg/mL）的Kdo2-lipid A,较野生菌（2.02μM）合成的LPS分子数量降低了35.1%。与传统Kdo2-lipid A生产菌WBB06相比,WJW00无抗性,生长情况更好,因此WJW00是合适的Kdo2-lipid A生产菌株。在WJW00基础上进一步敲除LpxD的抑制蛋白Npr编码基因ptsO,Kdo2-lipid A产量提高93.2%,达到5.68μg/mL;过表达LPS翻转蛋白编码基因msbA,Kdo2-lipid A产量提高25.5%,达到3.69μg/mL;过表达Kdo2-lipid A合成关键基因lpxC,Kdo2-lipid A产量提高189.8%,达到8.52μg/mL。（2）通过代谢物变化分析及转录组学研究了大肠杆菌LPS分子结构精简对细胞全局调控及聚3-羟基丁酸酯（PHB）合成效率的影响。进一步研究大肠杆菌LPS分子结构精简对细胞膜壁组成、胞内代谢和PHB合成的影响。首次发现rfaD基因敲除不仅影响磷脂组分比例还影响磷脂结构。LPS精简菌株WJW00较野生菌端部更为平整,鞭毛、分泌物减少,膜壁厚度减小,细胞破碎率显著提高,外膜蛋白OmpF减少;WJW00还表现出更强的疏水性、外膜渗透性、自凝集能力和抗生素敏感性,菌膜形成能力显著降低。大肠杆菌中rfaD基因的敲除影响细胞代谢,精简菌株发酵过程中,糖耗降低,pH升高,副产物丙酮酸、乳酸和乙酸分别降低77.1%、11.9%和59.0%。乙酰辅酶A增加3.7倍;丙氨酸降低80.0%,GABA提高46.5倍。进一步结合转录组学分析得出LPS分子精简可使得胞内C:N比例增高。针对上述代谢产物的定量结果,我们推断LPS分子精简可能有利于PHB生产。经验证,WJW00/pDXW-8-phaCAB、WJD00/pDXW-8-phaCAB和WJJ00/pDXW-8-phaCAB的PHB产量可达到细胞干重的67.8%、78.6%、84.8%,其产量分别较对照菌W3110/pDXW-8-phaCAB、DH5α/pDXW-8-phaCAB和JM109/pDXW-8-phaCAB提高300%,80.0%,75.0%;产率系数分别提高2.5倍、1.9倍和1.8倍。这归因于三个因素:（ⅰ）细胞壁膜的刚性降低,更易拉伸以容纳更多的细胞内容物;（ii）细胞外膜结构减少节省了细胞能量和资源;（iii）PHB前体物质乙酰辅酶A更加充足,副产物乙酸和乳酸合成较少,胞内C:N比例提高。（3）研究了删除25个LPS合成相关基因对大肠杆菌细胞的全局调控影响及其高效合成PHB的机制。利用多元位点特异性重组系统构建LPS基因簇精简菌株WJW02,从原料和合成步骤上彻底阻断LPS核心糖和O-抗原的合成,深入研究膜壁组分和表型,发现WJW02在细胞形态、膜壁厚度、磷脂、外膜蛋白、鞭毛、菌毛、胞外多糖与W3110均有很大差异;进而发现一系列膜壁特性、耐酸性、内膜渗透性、环境pH值、耐药性差异等。发酵过程中胞内外代谢物检测发现WJW02胞内乙酰辅酶A含量增加、三种有机酸含量降低、丙氨酸含量减少、GABA含量增加。进一步通过全局转录组学分析发现删除25个LPS合成基因影响4149个基因转录,涉及膜壁结构鞭毛、菌毛、胞外多糖、膜蛋白等,也包括胞内C源代谢和N源代谢,还影响细胞胁迫抗逆系统和全局调控因子等。将LPS精简菌株WJW02作为宿主菌应用于PHB的生产,WJW02/pBHR68细胞体积较W3110/pBHR68增大约25倍,PHB合成达到细胞干重的82.4%。LPS结构的截断可以大幅度提高PHB的生产效率。（4）通过删除59个鞭毛合成相关基因和9个菌毛合成相关基因改善大肠杆菌细胞特性来提高PHB合成效率。在W3110中,通过CRISPR/Cas9敲除系统分别删除59个和9个基因,获得鞭毛精简菌株WJW010和菌毛精简菌株WJW011。与W3110相比,WJW010细胞鞭毛缺失,运动性完全丧失,疏水性下降10.2%,菌膜形成量降低45.0%;WJW011的疏水性下降18.4%,菌膜形成量降低82.2%。这些基因簇的精简对细胞其他膜壁结构LPS、磷脂和外膜蛋白OmpF合成无影响,对其他膜壁表型无影响。在胞内代谢方面的影响,与W3110相比,WJW010细胞生长更快,糖耗降低,丙氨酸降低10.0%,GABA提高60.5%;WJW011细胞糖耗轻微降低;丙氨酸降低10.0%,GABA提高99.8%。引入PHB合成基因簇后,鞭毛基因簇精简使得细胞干重提高68.0%、PHB含量提高了11.5倍,为细胞干重的18.7%,但菌毛基因簇的精简对PHB合成影响较小。鞭毛基因簇的精简可以促进大肠杆菌合成PHB。在LPS精简菌株WJW02中继续删除68个鞭毛和菌毛合成基因,PHB合成情况基本与WJW02一致。（5）建立了两套适用于恶臭假单胞菌KT2442的基因组精简系统,并通过删除76个鞭毛和菌毛相关基因改善细胞特性,提高了PHA合成效率。精简系统I包括pK18mobsacB、pWJW101和pWJW102;精简系统II包括pZJD29c、pDTW202和pWJW103。通过敲除鞭毛结构基因PP4378并对比精简系统I、II与传统敲除系统的效率,结果显示:精简系统II中第一轮重组效率更高,精简系统I和II的二、三轮重组效率均可达到90%。最终采用精简系统II,高效连续删除菌毛基因簇PP2357-PP2363和鞭毛基因簇PP4329-PP439,获得菌株WJPP02和WJPP03。其中WJPP03缺失76个基因,占基因组比例为1.2%,WJPP03较KT2442生长情况改善、鞭毛和运动性缺失、菌膜形成能力降低、胞内信号因子c-di-GMP含量降低。WJPP03的PHA产量增加,添加C6底物己酸钠时,生物量提高19.1%,PHA产量提高73.4%;添加C12底物月桂酸时,生物量提高11.4%,PHA产量提高53.6%。