背景：鼠疫是由鼠疫耶尔森氏菌引起的自然疫源性疾病，在人类历史上曾经多次暴发流行。在感染宿主的过程中，鼠疫菌必须及时调整以适应外部环境压力同时维持其毒力和致病性，这些调整过程伴随着鼠疫菌基因调控的变化。毒力调节因子通过毒力调节网络对各个靶基因的表达进行上调或下调，其中调节因子Hfq和CRP的调节过程在毒力调节过程中起着特别重要作用。Hfq是sRNA分子伴侣，介导sRNA与靶mRNA之间的相互作用，基因hfq的缺失会导致鼠疫菌毒力的下降。环化腺苷单磷酸受体蛋白（CRP）在碳源代谢产物抑制过程中起重要作用，是鼠疫菌在宿主体内生存繁殖过程中根据外部碳源调整自身代谢途径以及能量代谢过程的核心因子；Crp基因的缺失会导致鼠疫菌毒力的减弱。本实验希望对鼠疫菌毒力调节的两个因子Hfq和CRP的作用机制进行研究。方法：采用基于-Red重组系统的基因突变方法，分别突变鼠疫菌基因hfq和crp，构建鼠疫菌hfq突变株（hfq）和crp突变株（crp）。对Hfq研究方面，通过表型实验验证鼠疫菌hfq基因的缺失对生物膜形成的总体影响。通过-半乳糖苷酶活性实验反映Hfq对各靶基因转录启动水平的调节情况。通过引物延伸实验反映各靶基因转录至mRNA水平受Hfq影响。在比较hms各个基因翻译至蛋白水平的变化方面，先将hms各个基因重组表达并免疫兔子得到多抗，再进行western blot实验。使用液相色谱-质谱联用技术分析了鼠疫菌野生株、 hfq株和C-hfq株胞内c-di-GMP的水平。对CRP研究方面，通过生长曲线和不同的培养基比较了鼠疫菌野生株和crp生长情况的差异。通过引物延伸实验和-半乳糖苷酶活性实验，验证了CRP对其自身基因和编码腺苷酸环化酶的基因（cyaA）转录调节作用。使用电泳迁移实验（EMSA）和DNA酶Ⅰ足迹实验得出了CRP对其自身基因和编码腺苷酸环化酶基因的结合位点。比较了鼠疫菌野生株和crp株胞内cAMP的浓度。结果：对于Hfq因子，在质粒pCD1存在的情况下，Hfq对生物膜形成过程起正调节作用；而在缺失质粒pCD1的情况下，Hfq对生物膜形成过程起负调节作用。-半乳糖苷酶活性实验表明，Hfq对hmsP基因的转录启动为负调节作用，对hms其他基因在转录启动没有作用。引物延伸实验表明，在转录后的mRNA水平Hfq对hmsHFRS，hmsT基因是正调节，对hmsP基因是负调节，对hmsD基因无调节。Western blot实验表明，在转录后蛋白水平Hfq对hms各基因调节结果同其在mRNA水平的调节结果。对于CRP因子，基因crp的缺失导致鼠疫菌生长受到影响， crp株生长速率以及平台期菌浓度均低于野生株。-半乳糖苷酶活性实验表明，CRP对自身基因的转录启动无调节，而对基因cyaA负调节。引物延伸实验显示，CRP对基因crp的mRNA无调节，而对基因cyaA负调节。基因crp的转录起始位点为A（-285），基因cyaA的转录起始位点为G（-133）。电泳迁移阻滞实验和DNA酶I足迹实验证明，CRP对基因cyaA有直接结合作用。胞内环化腺苷单磷酸（cAMP）浓度的测定进一步证实CRP对基因cyaA的负调节作用。结论：本研究对鼠疫菌中两个毒力调节因子Hfq和CRP在各自的毒力调节途径——生物膜的形成和腺苷酸环化酶调节，分别进行了研究。结果表明：质粒pCD1的存在对Hfq调节生物膜的过程有较大影响，在质粒存在的情况下Hfq对生物膜是正调节，在质粒缺失的情况下Hfq对生物膜是负调节。Hfq通过转录后方式正调节hmsHFRS，hmsT，通过转录和转录后方式负调节hmsP，共同调节生物膜形成，hmsD在本实验条件下不参与Hfq调节生物膜的过程。CRP对其自身基因无调节，并且不作用于自身基因启动子区。CRP结合于编码腺苷酸环化酶的基因（cyaA）启动子区的-10序列附近，并且抑制其转录。CRP通过作用于腺苷酸环化酶基因来抑制cAMP的产生，这代表了鼠疫菌中CRP负反馈自调节的一种机制。