IgA肾病是一种自身免疫性疾病,其特征在于肾小球系膜区中IgA免疫复合物的沉积,是中国也是全世界最常见的原发性慢性肾小球疾病和终末期肾病的主要原发病。尽管有可用的治疗方案,但IgA肾病的预后并不乐观,仍有大约50%的患者在30年内进展到终末期肾脏病。防己黄芪汤具有益气固表、祛风除湿利水的功效,主治卫虚不固,水湿内停之水肿,我科应用它来治疗IgA肾病在改善临床症状、延缓疾病进展方面疗效显著。前期体外实验研究也证实防己黄芪汤的有效成分之一汉防己甲素在μM浓度下能有效抑制健康志愿者外周血淋巴细胞的增殖并能协同增加糖皮质激素的免疫抑制效果。因此,本实验在前期研究的基础上从淋巴细胞亚群分泌的炎症因子探讨防己黄芪汤治疗IgA肾病的机制。目的:分离培养IgA肾病患者的外周血淋巴细胞,再用防己黄芪汤人源性的含药血清干预,探讨防己黄芪汤对IgA肾病患者外周血淋巴细胞炎症因子分泌的影响。再通过对IgA肾病患者提取的IgA1诱导的正常人肾小球系膜细胞的增殖、细胞外基质和炎症因子的分泌;以及IgA肾病患者外周血淋巴细胞分泌的炎症因子与人肾小球系膜细胞共培养对p38 MAPK信号通路的变化规律进行研究,进一步探讨防己黄芪汤通过阻断p38 MAPK,减少淋巴细胞亚群分泌的某些炎症因子,从而达到减少系膜细胞的增殖和细胞外基质的分泌,达到治疗IgA肾病和延缓疾病进展的目的,为中医“益气固表,祛风除湿”法治疗IgA肾病提供科学依据。方法:一、体内实验1、含药血清的制备。选取志愿者10名,5男5女。在干预之前,早晨空腹抽取肱静脉血20ml,处理分离血清,为空白对照组血清。随即所有志愿者服用防己黄芪汤颗粒剂,连续6天,处理分离血清,用作含药血清。2、基于高效液相色谱法(HPLC)技术的防己黄芪汤健康志愿者含药血清有效成分的检测。色谱柱使用安捷伦Agilent 883975-902 SBC18 Analytical HPLC Col 4.6x150 1 SB-C18分析柱,流动相:0.1%甲酸水溶液(A)—乙腈(B)进行梯度洗脱,梯度洗脱的程序为:0~20min,A:90%→40%;20~40min,A:40%→25%。检测波长:205、277nm;流速:0.8mL/min;柱温:30℃。二、体外实验实验一1、人外周血淋巴细胞悬液的制备。从慢性肾脏病队列研究中收集10例IgA肾病患者,每人收集15ml新鲜全血用于分离IgA1和淋巴细胞。使用淋巴细胞分离液梯度密度离心法从全血中分离人外周血淋巴细胞(HPBL)。2、采用CCK-8法检测健康人血清和10%胎牛血清作用的等效性,确定培养HPBL细胞时健康志愿者血清的加入浓度。3、细胞分组及干预。将前面分离的健康人和IgA肾病患者的HPBL,分为对照组、正常组、模型组、治疗组进行相应干预,干预后的细胞继续培养48h,检测随后的指标。4、指标检测。48h后离心取上清测量细胞因子浓度,ELISA法测Th1、Th2、Th17细胞因子(IL-4、IL-6、IL-17、TNF-α、TGF-β1、IFN-γ)的含量。实验二1、采用CCK-8法检测健康人血清与10%胎牛血清作用的等效性,确定健康志愿者血清培养人肾系膜细胞(HMC)的加入浓度。通过LDH的方法检测含药血清对HMC细胞的毒性作用。2、血浆IgA1的制备。采用Jacalin凝集素亲和柱富集的方法从健康人及IgA肾病患者收集的血浆进行提取、聚合IgA1。3、细胞分组及干预。以健康人及IgA肾病提取的IgA1诱导正常人系膜细胞建立模型,然后分正常组、模型组、治疗组3组进行干预,将细胞培养48h后,检测相应指标。4、指标检测。通过CCK-8方法检测人肾小球系膜细胞的增殖率。ELISA法测Th1、Th2、Th17细胞因子(IL-4、IL-6、IL-17、TNF-α、TGF-β1、IFN-γ)的含量,ELISA法检测系膜细胞分泌的细胞外基质纤维连接蛋白(FN)、前胶原蛋白Ⅲ(PCⅢ)、Ⅳ型胶原蛋白(COL4)的含量。实验三1、实验分组及干预。以健康人和IgA肾病患者HPBL培养24h分泌的炎症因子诱导HMC,然后将细胞分为健康空白组、健康加药组、IgA+空白血清、IgA+含药血清组、IgA+阻断剂组5组进行相应干预,培养48h后,收集细胞用于随后的指标检测。2、指标检测。RT-PCR检测各组细胞TGF-β1、IL-6、p38 MAPK的mRNA的表达,Western Blot检测TGF-β1、IL-6、p38、p-p38蛋白的表达,免疫荧光检测各组HMC细胞中IL-6、TGF-β1、p38的表达。结果:一、体内实验1、经与对照品保留时间对比,确定健康志愿者防己黄芪汤含药血清中含有粉防己碱、白术内酯Ⅰ原形化合物的结构,未检测到含有黄芪甲苷。通过线性回归方程计算,粉防己碱、白术内酯Ⅰ在健康志愿者防己黄芪汤含药血清中的含量分别为0.21μg/mL、0.97μg/mL。二、体外实验实验一1、CCK-8的结果显示5%、15%、20%健康人血清对HPBL的存活率与10%FBS相比存在显著性差异(P<0.05)。10%健康人血清组与10%FBS相比HPBL的存活率相当,且无显著性差异(P>0.05)。故而后续实验选择10%健康人血清作为实验的最终浓度。2、结果显示对照组以及模型组两组均比正常组的HPBL分泌的炎症因子IL-6、TGF-β1、TNF-α、IL-4、IL-17增多,分泌的IFN-γ减少,差异均有显著统计学意义(P<0.05)。而治疗组较模型组分泌的IL-6、TGF-β1、IL-4、IL-17降低,IFN-γ的分泌增加,差异均有显著统计学意义(P<0.05),分泌的TNF-α虽然也减少,但差异无统计学意义(P>0.05)。实验二1、CCK-8的结果显示,与10%FBS相比,20%、25%、30%健康人血清对细胞存活率存在显著性差异(P<0.05)。10%、15%健康人血清组与10%FBS相比HMC的存活率相当,无显著性差异(P>0.05)。10%健康人血清组的细胞存活率比15%要高,且与10%FBS组的细胞存活率更接近,故而后续实验选择10%健康人血清作为实验的最终浓度。LDH结果表明,与10%FBS组相比,10%健康人空白血清、10%防己黄芪汤含药血清对HMC的LDH活性的影响均无统计学差异(P>0.05),表明健康人空白血清、防己黄芪汤含药血清对HMC细胞无毒性作用,可用于后续实验。2、经从IgA肾病患者血清中提取的IgA1诱导后的模型组比正常组HMC的增殖率高(P<0.05),而经防己黄芪汤含药血清干预的治疗组HMC的增殖率比模型组降低(P<0.05)。模型组比正常组分泌的细胞外基质FN、PCⅢ、COL4升高,差异有显著的统计学意义(P<0.05)。而治疗组比模型组分泌的细胞外基质FN、PCⅢ、COL4又降低,差异也有显著统计学差异(P<0.05)。模型组比正常组的HMC分泌的IL-6、IFN-γ、TGF-β1、TNF-α、IL-4、IL-17升高,差异有显著的统计学意义(P<0.05)。治疗组比模型组HMC分泌的IL-6、IFN-γ、TGF-β1、TNF-α、IL-4、IL-17降低,除了TNF-α的降低无明显统计学差异外(P>0.05),其余5个炎症因子的差异都有显著统计学意义(P<0.05)。实验三1、IgA+空白血清组HMC细胞中IL-6、TGF-β1、p38MAPK mRNA呈高表达。IgA+空白血清组较健康空白组IL-6、TGF-β1、p38MAPK mRNA的表达明显升高(P<0.05),IgA+含药血清组较IgA+空白血清组IL-6、TGF-β1、p38MAPK mRNA的表达降低(P<0.05),IgA+阻断剂组与健康加药组之间IL-6、TGF-β1、p38MAPK mRNA的表达无明显统计学差异(P>0.05),IgA+阻断剂组较IgA+空白血清组的IL-6、TGF-β1、p38MAPK mRNA的表达都降低(P<0.05)。2、IgA+空白血清组HMC细胞IL-6、TGF-β1、p38、p-p38蛋白也呈高表达,其表达水平相较于其他四组最高。健康空白组的IL-6、TGF-β1、p38、p-p38蛋白水平较IgA+空白血清组低(P<0.05),IgA+含药血清组较IgA+空白血清组IL-6、TGF-β1、p38、p-p38蛋白的表达降低(P<0.05),IgA+阻断剂组与健康加药组之间IL-6、TGF-β1、p38、p-p38蛋白的表达无明显统计学差异(P>0.05),IgA+阻断剂组较IgA+空白血清组的IL-6、TGF-β1、p38、p-p38蛋白的表达都降低(P<0.05)。3、免疫荧光结果显示IgA+空白血清组比健康空白组分泌表达的IL-6、TGF-β1、p38更高,IgA+含药血清组与IgA+阻断剂组具有相同的效应能降低IL-6、TGF-β1、p38的水平。结论:1、健康志愿者防己黄芪汤含药血清中的有效成分为粉防己碱、白术内酯Ⅰ,这为该制剂的进一步药理机制研究提供了参考。2、IgA肾病患者较正常人的HPBL会分泌更多的炎症因子IL-6、TGF-β1、TNF-α、IL-4、IL-17但却分泌较少的IFN-γ,IgA肾病患者的IgA1可诱导正常人的HMC增殖增多,细胞外基质FN、PCⅢ、COL4的分泌增多,炎症因子IL-6、IFN-γ、TGF-β1、TNF-α、IL-4、IL-17的分泌增多。3、防己黄芪汤具有良好的调节外周血淋巴细胞和肾系膜细胞分泌的炎症因子IL-6、IFN-γ、TGF-β1、TNF-α、IL-4、IL-17,减少系膜细胞的增殖和细胞外基质FN、PCⅢ、COL4的分泌,其机制可能是通过阻断p38 MAPK活化,从而减少TGF-β1和IL-6的生成,进而减少系膜细胞的炎症反应,减少肾小球系膜细胞增殖和系膜外基质的沉积,从而延缓IgA肾病进展。