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抗菌肽(antibacterial peptide,ABP)是生物体内经诱导产生的一种具有生物活性的小分子多肽,分子量在2000到7000左右,由20到60个氨基酸残基组成。Cecropin B(天蚕素B)是由Boman最早从天蚕体内分离到的,是一类可诱导的、小分子量、热稳定性、广谱抗菌的可溶性抗菌肽。天蚕素B不仅具有广谱的抗菌作用,还能能选择性杀伤肿瘤细胞,天蚕素B对人髓样白血病细胞、艾氏腹水瘤、宫颈癌细胞、直肠癌及肝癌细胞均有杀伤作用,但对正常的哺乳动物细胞和昆虫细胞却无不良影响。Angiostatin是纤溶酶原(plg)的降解片断,主要由纤溶酶原的前四个饼环区组成。1997年,Cao等发现纤溶酶原的第五个饼环区(plasminogen kringle5,hPgnK5)同样具有抑制血管内皮细胞增殖和肿瘤生长的能力,且抑制能力强于Angiostatin。正常的肿瘤的发生、发展和转移必须依赖于新血管的生成,Kringle5对新血管生长的抑制作用表现为对肿瘤血管生长的抑制。通过对血管生长的抑制作用而强烈的抑制肿瘤细胞的生长,使肿瘤组织萎缩、消失。 本研究主要通过基因重组的方法,将Cecropin B和肿瘤血管生长抑制因子Kringle5的编码基因连接到高效的大肠杆菌表达载体pET32a上进行融合表达。首先根据GenBank中抗菌肽Cecropin B基因序列和相关资料,利用大肠杆菌偏爱密码子设计抗菌肽Cecropin B基因序列,将整个基因划分为A、B、C、D共4个片段,分别合成。通过重叠区扩增法(Gene splicing method of overlap extension,gene SOEing)合成完整的天蚕抗菌肽基因。根据肿瘤血管生长抑制因子Kringle5基因上下游的碱基序列设计上下游引物,通过PCR以已有的含有该基因的质粒为模板扩增出完整的Kringle5基因。 将PCR扩增出来的CB基因、K5基因和表达性载体pET32a分别用相应的限制性内切酶切割后,凝胶电泳回收目的条带,然后用T4 DNA连接酶将三者连接。将重组质粒转入大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)中,经酶切鉴定和测序,表