目的：子宫颈癌是全球发病率位居第二的女性恶性肿瘤，仅次于乳腺癌。高危型人乳头瘤病毒（HPV）感染已被确定是子宫颈癌的致病因素，尤以HPV16和18型最常见，其中E6和E7基因是HPV主要的癌基因。上皮-间质转化（EMT）在肿瘤发生发展和侵袭、转移过程中扮演重要角色,使肿瘤细胞具有高侵袭性和抗药性特征，wnt/β-catenin和TGF-β/Smad信号通路是EMT发生过程中重要的信号转导通路，有关HPV与子宫颈上皮细胞发生EMT之间的关系尚缺乏研究，其具体信号通路尚未阐明，本研究欲了解HPV16E6E7基因对子宫颈上皮细胞EMT的作用及信号转导分子的变化，旨在探讨HPV16E6E7基因与子宫颈上皮细胞发生EMT的关系和可能的信号转导机制。方法：1取2012年8月到2013年3月期间在河北医科大学第二医院，因子宫肌瘤或子宫腺肌症行子宫切除患者的宫颈标本进行原代培养，培养人宫颈上皮细胞，年龄<65岁，术前TCT检查除外宫颈病变，HPV检测结果为阴性，术后病理显示宫颈无异常或有慢性宫颈炎。2采用阳离子脂质体法将HPV16E6E7转染正常宫颈原代细胞，观察转染前后细胞形态学变化，并通过实时定量PCR（qRT-PCR）方法检测转染前后细胞中E-cadherin、N-cadherin、β-catenin、wnt1、Smad4及TGF-β1在转录水平的变化。结果：1影响细胞原代培养的因素采用消化法培养的原代细胞，取材65例，培养成功45例，成功率达69%，分析影响细胞培养能否成功的因素包括：患者年龄<60岁者，培养成功率高于>60岁者；取材处组织未被器械损伤者培养成功率超过有损伤者；术中子宫离体时间15分钟内进行取材成活率较高；术前体格检查未发现宫颈或阴道炎症，TCT提示正常或轻度炎症者培养成功率高于有阴道炎或重度宫颈炎症者；dispaseⅡ消化时间随着季节变化而变化，一般在20小时左右；K-SFM培养基较DMEM或1640培养基更适合于宫颈上皮细胞原代培养。2正常宫颈原代上皮细胞转染HPV16E6E7前后细胞形态学的变化经免疫细胞化学染色可见，原代培养的正常宫颈上皮中，间质细胞标志波形蛋白染色阴性，而上皮细胞标志E-钙粘蛋白染色阳性，可证明培养的为宫颈上皮细胞。转染前后倒置显微镜下观察细胞形态均为多边形，胞浆均丰富，与转染前相比较形态上未发现明显变化。3转染前后HPV16E6、E7和EMT相关基因N-cadherin、E-cadherin、β-catenin mRNA表达水平的变化qRT-PCR结果显示，正常宫颈上皮细胞转染HPV16E6E7基因48小时后，HPV16E6和HPV16E7mRNA均明显上升（P <0.05），表明转染成功。E-cadherin和β-catenin mRNA明显降低（P <0.05），而N-cadherinmRNA明显升高（P <0.05），空白转染组与阴性对照组比较均无明显差异（P均>0.05）。4转染前后TGF-β1、smad4和wnt-1mRNA的变化经qRT-PCR检测发现，正常宫颈上皮细胞转染HPV16E6E7基因48小时后，TGF-β1、wnt-1基因表达明显升高（P <0.05），smad4则明显降低（P <0.05），空白转染组与阴性对照组比较无明显差异（P均>0.05）。结论：1上皮细胞培养专用无血清培养基（K-SFM）可成功用于宫颈上皮细胞的原代培养，尤其推荐联合dispaseⅡ和胰酶消化法。2HPV16E6E7基因瞬时转染人宫颈鳞状上皮细胞细胞后，光镜下检查细胞形态在转染后48小时未发生明显变化。3HPV16E6E7基因转染人宫颈鳞状上皮细胞后，上皮性标志物E-cadherin表达明显下降，而间质性标志物N-cadherin表达明显增高，表明HPV16E6E7基因可以引起人宫颈上皮细胞发生EMT过程。4HPV16E6E7基因转染人宫颈鳞状上皮细胞后，TGF-β1、wnt-1基因表达明显增高，而smad4和β-catenin表达明显下降，导致细胞间连接减少、侵袭转移能力增加，提示HPV16E6E7基因可能是通过wnt/β-catenin和TGF-β/smad4信号通路使宫颈上皮细胞发生EMT、进而促进癌变的进程。