论文部分内容阅读
大多数病毒基因组比较简单,编码的蛋白相对较少,病毒成功感染生物体通常会依赖宿主细胞的物质和功能。在病毒不同的感染阶段,会改变宿主细胞正常的生理结构和功能,为病毒自身复制增殖所用。杆状病毒是已知昆虫病毒中的最大类群,也是发现最早、研究最多且使用意义较大的一类昆虫病毒,杆状病毒代表种家蚕核型多角体病毒（Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV）又是家蚕重大病害血液型脓病的病原。因此,以BmNPV为研究对象,阐释BmNPV调控宿主细胞机制的研究,不仅对完善杆状病毒这一主要类群病原调控宿主复制增殖的机制具有重要的生物学意义,而且能够为家蚕主要病原BmNPV的防控提供理论支撑。在先前研究中,我们发现BmNPV能够诱导细胞周期阻滞在G2/M期,促进自身增殖复制,但是影响细胞周期阻滞的关键病毒因子和宿主因子依然不清楚。鉴于此,本研究首先筛选确定了BmNPV晚期表达因子11（late expression factor11,lef-11）能够阻滞细胞周期在G2/M期;进一步确定BmNPV LEF-11调控家蚕诱导型金属蛋白酶抑制剂（Bombyx mori inducible metalloproteinase inhibitor protein-like,BmIMPI）的作用机制;并分析BmIMPI表达特征及调控宿主细胞周期的特征;同时,确定了BmNPV LEF-11介导BmIMPI调控宿主细胞周期的机制。本研究阐释了BmNPV LEF-11与宿主蛋白BmIMPI相互作用影响家蚕细胞周期进程的机制,完善了杆状病毒与宿主细胞的相互作用机制的研究,可为BmNPV的防控提供了理论基础。本研究获得的主要研究结果如下:1.BmNPV lef-11对细胞周期的调控为了鉴定BmNPV lef-11对细胞周期的影响,在过表达BmNPV lef-11后检测细胞增殖的变化,结果显示与对照相比细胞增殖活力下降;通过Ed U标记检测BmNPV lef-11对细胞DNA复制的影响,结果显示过表达BmNPV lef-11后24 h、48 h和72 h后,相比于对照,被Ed U标记的细胞显著性的减少,表明细胞DNA复制受到了抑制;流式细胞术分析细胞周期变化显示过表达BmNPV lef-11将细胞周期阻滞在了G2/M期,G2/M期细胞显著增加。为了探究调控机制,本研究在过表达BmNPV lef-11的情况下,检测细胞增殖和细胞周期相关基因的变化。结果显示,相比与对照过表达BmNPV lef-11后,增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen,PCNA）、G2/M期检验点细胞周期蛋白B（Cyclin B）和细胞周期蛋白依赖性激酶1（Cyclin-dependent kinase 1,CDK1）表达水平均下调。Western blotting分析结果显示过表达BmNPV lef-11后与对照相比BmCyclin B蛋白表达水平下降。Co-IP验证BmNPV LEF-11与BmCyclin B是否具有直接相互作用,结果表明BmNPV LEF-11与BmCyclin B无直接相互作用。以上结果表明BmNPV lef-11可通过阻滞细胞周期于G2/M期,下调周期蛋白如BmCyclin B表达水平来调控宿主细胞周期变化,但是BmNPV LEF-11与BmCyclin B无直接互作,BmNPV LEF-11是如何调控细胞变化的机制仍未解析,因此钓取BmNPV LEF-11在细胞中的互作蛋白,以探究其调控细胞周期的机制。2.BmIMPI的基本特征分析及与BmNPV LEF-11的相互作用验证前期研究发现BmNPV lef-11能够调控细胞周期,为了研究其调控细胞周期的机制,通过免疫共沉淀和酵母双杂交钓取BmNPV LEF-11相互作用蛋白。基于基因功能分析,本研究从BmNPV LEF-11互作的候选蛋白中筛选出BmIMPI,对其进行了克隆及基本特征分析。BmIMPI富含大量半胱氨酸残基,预测具有2个胰蛋白酶抑制剂类似半胱氨酸丰富结构域（Trypsin inhibitor like cysteine rich domain,TIL）。同源序列比对及系统进化树发现BmIMPI在其他物种中的序列保守性较低。组织表达谱分析显示BmIMPI在丝腺中高表达,时期表达谱分析显示BmIMPI在眠期表达量较低,盛食期表达量较高,5龄至游走期高表达,推测BmIMPI参与细胞增殖和细胞周期调控。为了验证BmIMPI与BmNPV LEF-11的相互作用,在细胞中转染p IZ-LEF11Flag、p IZ-IMPIHA-EGFP质粒48h后再加入BmNPV诱导,免疫荧光共定位发现BmIMPI与BmNPV LEF-11可共定位于细胞核,因此推测BmIMPI与BmNPV LEF-11可能存在相互作用。进一步利用免疫共沉淀技术和Western bloting技术验证BmNPV LEF-11与BmIMPI的相互作用关系,发现BmIMPI和BmNPV LEF-11具有相互作用。q RT-PCR结果显示,相比于对照,过表达BmNPV lef-11后BmIMPI的表达升高。以上结果表明BmNPV LEF-11与BmIMPI相互作用,可调控BmIMPI的表达。3.探究BmIMPI对细胞周期的调控基于基因功能分析,为了确定BmNPV lef-11调控BmIMPI影响细胞周期,本研究在BmN-SWU1中过表达BmIMPI后检测细胞增殖的变化。结果显示相比于对照,过表达BmIMPI后细胞增殖活力降低。Ed U结果显示,与对照相比,过表达BmIMPI后被Ed U标记的细胞显著性的减少,即细胞DNA复制受到了抑制,导致细胞增殖受到抑制。流式分析发现,过表达BmIMPI将细胞周期阻滞在了G2/M期,G2/M期细胞增加。以上结果表明BmIMPI通过阻滞细胞周期于G2/M期,从而调控细胞的复制增殖。为了验证BmIMPI是细胞内调控细胞周期的关键基因,本研究在干涉BmIMPI的表达后检测对细胞增殖的影响。结果发现,干涉BmIMPI后细胞增殖活力增加,Ed U标记的细胞数显著性的增加,表明促进了细胞DNA的复制;流式细胞分析表明干涉BmIMPI后G2/M期细胞减少。以上结果说明BmIMPI参与了细胞周期调控。4.BmNPV lef-11通过BmIMPI调控宿主细胞周期的机制研究为了验证BmNPV lef-11是通过BmIMPI调控了宿主细胞周期,本研究在过表达BmNPV lef-11的同时下调BmIMPI的表达。Ed U结果表明,在过表达BmNPV lef-11的同时干涉BmIMPI,被标记的细胞数与对照相比无显著差异,表明BmNPV lef-11是通过BmIMPI调控了宿主细胞DNA复制。流式细胞术分析周期变化证明在过表达BmNPV lef-11的同时干涉BmIMPI后,G2/M期细胞无显著差异。以上结果证明了BmNPV lef-11是通过BmIMPI调控了宿主细胞增殖。为了探究BmIMPI调控细胞周期的机制,本研究在过表达BmIMPI后发现,相比于对照组,过表达BmIMPI后24h,BmPCNA、BmCyclin B和BmCDK1表达水平显著性的下调,过表达BmIMPI后36 h,BmCyclin B和BmCDK1表达水平显著性的下调;而干涉BmIMPI的表达后,相比于对照,干涉BmIMPI后24 h,BmPCNA表达水平上调,干涉BmIMPI后36 h,BmCyclin B和BmCDK1上调表达。结合Western blotting分析结果显示相比于对照,过表达BmIMPI后BmCyclin B蛋白的表达明显降低,而干涉BmIMPI的表达后BmCyclin B蛋白表达明显增加。免疫荧光发现BmIMPI能与BmCyclin B发生共定位。以上结果证明了BmNPV lef-11是通过BmIMPI调控了宿主细胞增殖。因此,本研究鉴定了BmNPV LEF-11通过与BmIMPI相互作用,并通过调控下游基因的表达调控细胞周期,从而抑制宿主细胞增殖。