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有机酸种类和含量是影响果实风味品质和加工品质的重要因素之一,在苹果果实中苹果酸占有机酸总量的80%以上,是主要的有机酸。此外,苹果酸参与多个代谢途径,在植物逆境胁迫适应方面发挥重要作用。为了研究苹果果实中酸度形成的分子机制以及苹果酸在果树逆境胁迫适应方面所发挥的作用,我们将MdcyMDH基因转化王林愈伤组织和番茄,鉴定MdcyMDH基因在苹果酸积累、植物生长和抗逆性中的功能。主要结果如下:
1.MdcyMDH定位在细胞质和质膜上
在转化空载体pBIN的洋葱表皮细胞中,GFP绿色荧光均匀分布在整个细胞中;而表达MdcyMDH-GFP融合蛋白的洋葱表皮细胞中,只有质膜和细胞质中才能够检测到绿色荧光信号。以上实验结果表明,MdcyMDH蛋白不仅定位在细胞质中,还定位在质膜上。
2.MdcyMDH基因的表达分析
时空表达结果显示,MdcyMDH基因在苹果茎、叶、花和果实中均有表达,并且在胁迫条件下表达下调;pMdcyMDH::GUS转化烟草结果也表明,MdcyMDH启动子驱动的GUS基因在烟草根、茎、叶等器官中呈组成型表达。另外,在苹果细胞悬浮系、组培苗、层积种子等细胞核器官中的表达分析表明,MdcyMDH基因的表达水平同植物的代谢活性和生长速度正相关性。
3.MdcyMDH基因过量表达可以促进王林愈伤组织和番茄果实的苹果酸积累
过量表达MdcyMDH基因的王林愈伤组织中苹果酸含量达到0.308 mg·g-1FW,而对照和反义MdcyMDH转基因愈伤组织中检测不到苹果酸;过量表达MdcyMDH基因的番茄果实中苹果酸含量也显著高于对照:同时,各转基因材料中的糖含量等也明显提高。以上结果表明MdcyMDH基因的过量表达可以促进王林愈伤组织和番茄果实中得苹果酸积累及其相关的糖异生等。
4.MdcyMDH基因的过量表达促进转基因王林愈伤组织和番茄的生长
过量表达MdcyMDH基因的愈伤组织生长状态和相对生长量明显好于对照,同时,MdcyMDH转基因番茄的株高和根茎直径也高于野生型对照。以上结果表明,MdcyMDH基因的过量表达促进转基因苹果愈伤组织和番茄的生长。
5.MdcyMDH基因的过量表达可以提高转基因苹果愈伤组织和番茄的抗逆性胁迫条件下,MdcyMDH转基因苹果愈伤组织和番茄的抗性明显好于对照,同时,转基因材料中的过氧化物清除酶活性提高,活性氧含量降低,反映膜完整性的MDA和相对电导率也都明显降低,表明MdcyMDH基因的过量表达提高了转基因材料的抗逆性。
6.MdcyMDH与糖异生和氧化还原相关蛋白相互作用
双分子荧光互补分析结果显示,MdcyMDH分别与MdPEPCK、AtFBP和AtTrx-h1相互作用,其中MdPEPCK和AtFBP是葡糖异生途径的关键酶,AtTrx-h1是拟南芥硫氧还蛋白,参与调控细胞氧化还原平衡。