肠道微生物与免疫系统之间存在密切交流与互作机制。肠道微生物可以通过介导肠道上皮模式识别受体调节肠道免疫应答。此外,微生物对蛋白质、碳水化合物、脂的代谢产物也可以影响肠道黏膜免疫。在动物出生早期,肠道微生物不稳定,容易受外界环境的影响。在此阶段,肠道免疫系统未发育成熟,一些病原菌或者毒素可以通过肠道屏障进入血液引起炎症反应。在中国,抗生素被广泛的使用来促进仔猪生长性能。一些研究发现,抗生素增加致病菌的定植,抑制肠道免疫,暗示抗生素干预可能不利于肠道健康。此外,日粮蛋白水平影响肠道微生物的变化。研究发现适当降低日粮蛋白水平补充必需氨基酸增加肠道有益菌,减少大肠杆菌及蛋白质发酵产物,暗示低蛋白氨基酸平衡日粮可能有益于肠道健康。低蛋白氨基酸平衡日粮能否改善早期抗生素干预对肠道健康的不利影响?相对于小肠,大肠微生物的数量更多,而大肠微生物的改变对小肠健康影响的相关研究较少。本研究通过口服抗生素、饲喂不同蛋白水平日粮及回肠末端灌注抗生素的方式干预肠道微生物,从而研究肠道微生物对肠道黏膜和机体免疫的重要作用。1早期抗生素干预对仔猪肠道微生物及盲肠代谢产物的影响本章旨在研究早期抗生素干预对仔猪肠道微生物及盲肠代谢产物的影响。试验选取18窝杜长大三元杂交新生仔猪,在第7日龄,随机分为两组(对照组和抗生素组),每组9窝。对照组饲喂不含抗生素的日粮,试验组饲喂含饲用抗生素(查乙醇、土霉素钙与吉他霉素,各50 mg/kg)的日粮。在42日龄,每组随机选取8窝,每窝随机屠宰1头,利用高通量测序技术分析盲肠食糜中微生物的组成,同时测定盲肠微生物发酵产物。q-PCR测定空肠、回肠、结肠食糜中优势微生物菌群数量。结果显示,早期抗生素干预改变肠道微生物区系,降低短链脂肪酸产生菌(回肠和结肠食糜中 Clostridium cluster Ⅳ和Clostridi m cluster ⅩⅣa;盲肠食糜中Roseburia、Lachnospirapectinoschiza 和 Clostridium leptum 和 Lactobacillus(回肠和结肠)(P<0.05)。早期抗生素干预改变盲肠微生物发酵模式,增加蛋白质发酵产物(氨氮、腐胺、尸胺、对甲苯和吲哚)的含量(P<0.05),降低碳水化合物发酵产物(总短链脂肪酸、乙酸、丙酸、丁酸)的含量(P<0.05),以上结果表明早期抗生素干预导致仔猪肠道食糜中对肠道健康有利的短链脂肪酸产生菌、Lactobacillus和挥发性脂肪酸减少,不利的氨基酸代谢产物增加,影响肠道健康。2早期抗生素干预影响仔猪肠道黏膜及血清免疫状态本章在第一章动物试验的基础上,通过RT-PCR以及ELISA技术测定仔猪空肠、回肠、盲肠、结肠以及血液免疫指标,研究早期抗生素干预对仔猪肠道黏膜及血清免疫状态的影响。结果显示早期抗生素干预抑制肠道黏膜免疫,主要表现为降低回肠、结肠黏膜TLR-2 mRNA水平(P<0.05),降低肠道黏膜炎症因子mRNA和蛋白水平(空肠黏膜IFN-γ;回肠黏膜IL-10和TNF-α;盲肠黏膜IL-8、IL-10、IFN-γ和TNF-α;结肠黏膜IL-10和IFN-γ)(P<0.05),降低回肠、结肠黏膜mucin-2mRNA水平和肠道黏膜免疫球蛋白水平(空肠黏膜SIgA;回肠黏膜SIgA和IgG;盲肠黏膜SIgA;结肠黏膜IgG)(P<0.05)。早期抗生素干预抑制系统免疫反应,主要表现为降低血清中细胞因子(IL-8和IFN-γ)和免疫球蛋白(IgA和IgG)浓度(P<0.05)。以上结果表明,早期抗生素干预抑制仔猪肠道及系统免疫反应,主要表现为降低肠道黏膜和血清中细胞因子和免疫球蛋白水平,影响宿主免疫稳定。3早期抗生素干预对后期生长猪肠道微生物区系及代谢产物的影响本章旨在研究早期抗生素干预对后期生长猪肠道微生物区系及代谢产物的影响。试验选取出生日龄相同的18窝新生杜长大三元杂交仔猪,在第7日龄,随机分为两组,每组9窝。对照组饲喂不含抗生素的教槽料,试验组饲喂含饲用抗生素(喹乙醇、土霉素钙与吉他霉素,各50mg/kg)的日粮直到42日龄。从第42日龄开始,对照组和抗生素组的仔猪再分别分为两组,在42-77、77-120日龄两个阶段分别饲喂正常蛋白日粮(20%和18%)、低蛋白氨基酸平衡日粮(16%和14%),每组5栏,每栏9头。分别在77和120日龄,每栏屠宰1头(每组5头),采集空肠、回肠、盲肠、结肠内容物用于细菌结构及代谢产物分析。结果显示早期抗生素干预显著增加77日龄生长猪空肠、回肠食糜中条件致病性Escherichia coli数量,降低肠道食糜中潜在有益菌的数量(77日龄空肠、回肠食糜中Bifidobacterium;120日空肠、回肠和结肠食糜中Clostridium cluster ⅩⅣa)(P<0.05)。低蛋白氨基酸平衡日粮显著增加77日龄和120日龄生长猪肠道食糜中潜在有益菌的数量(Bifidobacterium、Clostridium cluster Ⅳ、Clostridium cluster ⅩⅣa 和 Lactobacillus),降低生长猪肠道食糜中条件致病性Escherichia coli数量(P<0.05)。对于大肠食糜中细菌代谢产物,在低蛋白氨基酸平衡日粮下,早期抗生素干预显著增加盲肠食糜中蛋白质发酵产物浓度(77日龄对甲苯和粪臭素;120日龄总胺、腐胺和亚精胺)(P<0.05)。正常蛋白日粮下,早期抗生素干预显著增加77日龄生长猪结肠食糜中芳香族氨基酸的发酵(苯酚和吲哚)(P<0.05)。低蛋白氨基酸平衡日粮显著增加77日龄生长猪大肠食糜中短链脂肪酸浓度(丙酸和丁酸),降低大肠食糜中蛋白质发酵产物浓度(77日龄氨氮、苯酚、吲哚;120日龄支链脂肪酸、氨氮、酪胺、尸胺、苯酚、吲哚)(P<0.05)。综上所述,早期抗生素干预降低后期生长猪肠道食糜中潜在有益菌的数量,短期内增加小肠条件致病性Escherichia coli数量。在正常蛋白或者低蛋白氨基酸平衡日粮下,早期抗生素干预增加后期生长猪大肠中蛋白质发酵。低蛋白氨基酸平衡日粮增加生长猪肠道食糜中对肠道健康具有有利作用的细菌和代谢物,降低不利于肠道健康的细菌和代谢物,有益于生长猪肠道健康。4早期抗生素干预对后期生长猪肠道黏膜及血清免疫状态的影响本章在第三章的动物试验的基础上,采集空肠、回肠、结肠黏膜及血清。RT-PCR以及ELISA测定肠道黏膜和血清免疫指标。结果显示,对于肠道免疫,早期抗生素干预显著降低77日龄生长猪空肠、回肠抗炎症因子IL-10的mRNA和蛋白水平。在正常蛋白水平日粮下,早期抗生素干预降低77日龄生长猪结肠IL-8和IFN-y的mRNA和蛋白水平(P<0.05)。此外,早期抗生素干预降低77日龄生长猪回肠SIgA和IgG以及结肠IgG的浓度(P<0.05)。低蛋白氨基酸平衡日粮显著下调结肠黏膜中TLR4、MyD88和NF-KBp65mRNA的表达(P<0.05),降低促炎症因子mRNA和蛋白水平(77日龄生长猪回肠IL-8和TNF-α和结肠IFN-γ;120日龄生长猪空肠IL-8和IFN-γ、回肠TNF-α、结肠IL-8和TNF-α)(P<0.05),上调120日龄生长猪空肠黏膜(ZO-1)、回肠黏膜(mucin-2和occludin)屏障功能的基因表达(P<0.05),增加肠道黏膜免疫球蛋白水平(77日龄生长猪空肠和结肠SIgA;120日龄生长猪空肠IgG)(P<0.05)。对于血清免疫指标,早期抗生素干预显著降低77日龄生长猪血清中IgA的浓度(P<0.05)。低蛋白氨基酸平衡日粮显著降低120日龄生长猪血清中促炎症因子IL-8的浓度,增加免疫球蛋白IgA的浓度(P<0.05)。对于免疫指标、微生物和代谢产物的相关性分析,发现Escherichia coli的数量与促炎症因子的水平存在显著正相关(P<0.05),表明低蛋白氨基酸平衡日粮下,肠道促炎因子水平的降低可能与Escherichia coli的减少有关。此外,结肠黏膜促炎因子的下调与苯酚、氨氮的减少以及TLR4-MyD88-NF-κB信号通路的下调呈显著正相关。以上结果表明,早期抗生素干预在短期时间内影响后期生长猪肠道黏膜免疫稳定,长期时间后影响减弱。低蛋白氨基酸平衡日粮调节生长猪肠道免疫功能,长期饲喂效果更加显著。5回肠末端灌注抗生素对生长猪空肠和结肠微生物区系及免疫状态的影响大肠微生物能够参与营养代谢,维持肠道免疫功能。然而,目前很少报道直接干预大肠微生物对小肠健康的影响。因此本文旨在研究回肠末端灌注抗生素对生长猪空肠、结肠细菌数量及免疫状态的影响。试验选取12头45日龄(体重为12.08士0.28 kg)在回肠末端装有T型痿管杜长大三元杂交仔猪,随机分为对照组和抗生素组,每组6头。其中对照组从瘘管灌注生理盐水(10 ml/d),抗生素组从瘘管灌注包含氨苄西林、庆大霉素、甲硝唑(浓度分别为150、4、30mg/kg/d)的生理盐水(10ml/d)。试验25天。试验期第25天采集空肠和结肠内容物检测主要微生物和短链脂肪酸,采集空肠和结肠黏膜以及血清测定免疫指标。结果显示回肠末端灌注抗生素影响肠道食糜中细菌,主要表现为降低结肠食糜中潜在有益菌数量,如:Bifdobacterium、Clostridium cluster Ⅳ和Clostridium cluster ⅩⅣa(P<0.05),增加 空肠食糜中条件致病性Escherichia coli(P<0.05)。回肠末端灌注抗生素显著降低结肠食糜中短链脂肪酸的浓度(总短链脂肪酸、丙酸、丁酸和异丁酸)(P<0.05)。回肠末端灌注抗生素抑制空肠和结肠免疫反应。在结肠,回肠末端灌注抗生素降低结肠黏膜IL-8、IL-10和sIgA 的浓度,下调IL-8、IL-10、mucin-1、mucin-和 ZO-1mRNA 表达(P<0.05)。在空肠,回肠末端灌注抗生素降低IFN-γ、TNF-α、SIgA和IgG的浓度,下调IFN-γ、TNF-α、mucin-2和ZO-1 mRNA表达(P<0.05)。回肠末端灌注抗生素抑制系统免疫反应,主要表现为降低血清细胞因子(IL-10、IFN-γ和TNF-α)和免疫球蛋白(IgA和IgG)的浓度(P<0.05)。以上结果表明,回肠末端灌注抗生素减少生长猪结肠食糜中潜在有益菌的数量,增加空肠食糜中条件致病性Escherichia coli数量,抑制结肠、血液以及空肠免疫反应。综上所述:(1)早期抗生素干预导致仔猪肠道食糜中对肠道健康有利的短链脂肪酸产生菌、Lactobacillus和挥发性脂肪酸减少,不利的氨基酸代谢产物增加,影响肠道健康。(2)早期抗生素干预抑制仔猪肠道和系统免疫反应,主要表现为降低肠道和血清中细胞因子及免疫球蛋白浓度,影响宿主免疫稳定。(3)早期抗生素千预降低后期生长猪肠道食糜中潜在有益的细菌数量,短期内增加小肠条件致病性Escherichia coli数量。在正常蛋白或者低蛋白氨基酸平衡日粮下,早期抗生素增加后期生长猪大肠中蛋白质发酵。低蛋白氨基酸平衡日粮增加生长猪肠道食糜中对肠道健康具有有利作用的细菌和代谢物,降低不利于肠道健康的细菌和代谢物,有益于肠道健康。(4)早期抗生素干预在短期时间内影响后期生长肠道黏膜免疫稳定,长期时间后影响减弱。低蛋白氨基酸平衡日粮调节肠道免疫功能,长期饲喂效果更加显著。(5)回肠末端灌注抗生素降低结肠食糜中潜在有益菌的数量,增加空肠食糜中条件致病性Escherichia coli的数量,抑制结肠、血清和空肠免疫反应。