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酸枣仁为鼠李科(Rhamnaceae)植物酸枣(Zizyphus jujuba Mill.var.spinosa(Bunge)Hu ex H.F.Chow)的干燥成熟种子,酸枣仁最早的记录可追溯于《神农本草经》是治疗失眠的首选中药。现代研究表明酸枣仁中所含有的皂苷类、黄酮类及脂肪酸类化学成分具有良好的镇静安神作用。目的:本论文以酸枣仁为研究对象,采用药效跟踪法,应用现代提取分离纯化技术寻找其改善睡眠的活性部位,针对该活性部位进行药效物质基础及作用机制的研究,为更好地开发利用酸枣仁这一传统中药材提供理论依据。方法:1、活性部位的分离与纯化研究:首先,以小鼠自主活动次数与戊巴比妥钠中枢协同性实验为考察指标,对依据文献报道具有改善睡眠作用的不同提取物进行药效学筛选,从中获得改善睡眠最佳提取物;其次,运用经典药物化学分离技术结合现代多壁碳纳米管萃取分离技术,采用正交实验对最佳提取物进行分离纯化及精制工艺研究,依据改善睡眠活性结果,从中获得改善睡眠的最佳活性部位。2、活性部位的药效物质基础研究:应用高效液相色谱、液质联用等现代分析技术对最佳活性部位中的有效组分及成分进行研究。在此基础上,依据所获得的有效组分及成分,应用Agilent-DAD-HPLC色谱仪,建立其高效液相指纹色谱图,运用所建立的指纹色谱图,应用血清药物化学方法对酸枣仁改善睡眠活性部位(SZR-ACT-MATT)改善睡眠药效物质基础进行研究。3、活性部位的作用机制研究:采用ELISA法测定大鼠下丘脑和海马体中Glu、GABA、5-HT、DA含量,采用PCPA失眠大鼠模型观察脑组织形态学;采用免疫组化法观察脑组织内GABAARα1、GABAARγ2阳性细胞的表达情况,探讨SZR-ACT-MATT的作用机制。结果:1、活性部位的分离与纯化研究表明:采用药效跟踪法,以小鼠自主活动次数与戊巴比妥钠中枢协同性实验为考察指标,针对所设计的5种提取物进行筛选,最终得到提取物2(醇提取物SZR-E2)为酸枣仁改善睡眠的最佳提取物。运用经典中药化学分离方法分离得到5个分离部位,针对最佳改善睡眠活性分离部位4(正丁醇部位SZRS4),采用现代多壁碳纳米管萃取分离纯化技术,分离纯化获得最佳改善睡眠活性精制物5(正丁醇洗脱物SZR-R5),酸枣仁改善睡眠最佳精制纯化工艺正交实验结果为:洗脱液用量(ml)与MWCNTs(g)的比值为40:1,药液浓度为1.5g/ml,超声提取30min。活性验证结果为:SZR-ACT-MATT>SZR-S4>SZR-E2,表明通过上述提取、分离、精制工艺的研究,最终成功地获得了酸枣仁改善睡眠活性部位(SZR-ACT-MATT)。2、活性部位的药效物质基础研究表明:针对SZR-ACT-MATT,通过高效液相有效组分分析表明,SZR-ACT-MATT中酸枣仁皂苷A、斯皮诺素、总黄酮、总皂苷、总生物碱、总多糖、总酚酸、总蛋白、总脂肪酸、的平均含量分别为0.586、0.184、2.114、6.851、0.985、0.811、0.997、0.031、5.833;应用液质联用技术从SZR-ACT-MATT中鉴定得到了24个化合物。在此基础上,采用高效液相法,运用中药色谱指纹图谱相似度评价软件,利用多点校正法建立了SZR-ACT-MATT指纹图谱,根据生成的14个共有峰指纹图谱模式图,使用对照品比对法,经过保留时间和色谱行为的相比,共指认9个色谱峰,分别为葛根素、阿魏酸、斯皮诺素、芦丁、橙皮苷、荷叶碱、槲皮素、酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B,这9个成分均包含在SZR-ACT-MATT液质分析结果中;运用所获得的指纹图谱,确定了大鼠血清中移行成分有26个,其中原型成分入血的有11个、15个为代谢产物,通过与对照品比较保留时间,指认了11个原型成分中7个成分分别为葛根素、阿魏酸、斯皮诺素、芦丁、槲皮素、酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B。3、活性部位的作用机制研究表明:形态学观察结果表明,阳性对照组、SZR-ACT-MATT各剂量与模型组相比失眠大鼠下丘脑、海马体内相关神经细胞大部分得以恢复;Glu、GABA的含量测定结果表明SZR-ACT-MATT各剂量组均能提高失眠大鼠下丘脑内GABA含量,降低Glu含量、仅有高剂量组可以提高海马体内GABA含量,5-HT、DA含量测定结果表明SZR-ACT-MATT可以一定程度地提高失眠大鼠脑组织中下丘脑和海马体的5-HT含量并同时降低DA含量,尤其SZR-ACT-MATT高、中剂量组可以显著提高海马体内5-HT的含量;免疫组化结果表明SZR-ACT-MATT可以显著提高失眠大鼠下丘脑内GABAARα1和γ2阳性细胞的表达,而对海马体内GABAARα1和γ2型阳性细胞的表达无显著差异性。基于以上实验结果可以证实SZR-ACT-MATT的作用机制为“SZR-ACT-MATT是基于GABA-A受体系统通路,通过调节脑组织中下丘脑的GABA及Glu含量来改善失眠的”。同时由于SZR-ACT-MATT高、中剂量组可以显著提高海马体内5-HT的含量,因此我们推断SZR-ACT-MATT其作用机制与海马体内5-HT受体也可能具有一定的关联性。结论:本实验采用药效跟踪法通过现代提取分离纯化技术得到SZR-ACT-MATT,在此基础上应用质谱分析、HPLC指纹图谱、血清药物化学、免疫组化等研究,初步论述了SZR-ACT-MATT的药效物质及作用机制,为更好地开发利用SZR-ACT-MATT奠定了理论基础。