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背景随着社会和工业化的快速发展,空气污染已经成为全球性社会公害问题,在我国尤其严重。目前我国针对以颗粒物为主的雾霾污染的治理已经初见成效。与此同时,臭氧作为广泛存在的二次污染物,在我国空气污染中的地位正在逐渐凸显,并且已经发展成为引起人群健康危害的主要污染物之一。当前,大量的体内外研究均证实,臭氧可以直接影响人体呼吸系统造成健康危害。但是,臭氧对人体心血管系统损伤效应的证据大多还是流行病学研究,尚不清楚臭氧具体的作用途径和机制。动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)不仅是一种严重危害人群健康的心血管疾病,同时也是心血管疾病的主要病理基础之一,血管内皮细胞在动脉粥样硬化发生发展过程中发挥重要作用。目的利用体外共培养模型,探究臭氧能否诱导共培养人冠状动脉内皮细胞发生动脉粥样硬化样改变,其具体的作用途径和机制是什么?方法本研究基于臭氧作用心血管系统的途径,构建了肺泡上皮细胞(A549)/人冠状动脉内皮细胞(Human Coronary Artery Endothelial Cells,HCAEC)共培养模型。将A549细胞培养于Transwell小室,HCAEC细胞培养于12孔板,构建共培养模型,同时设置单独暴露A549细胞及HCAEC细胞模型。分别在0ppb、50ppb、100ppb、200ppb、400ppb臭氧浓度下暴露4h,收集培养液上清和细胞。利用乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase,LDH)试剂盒检测细胞损伤情况;利用ELISA试剂盒检测炎性因子白介素-6(Interleukin-6,IL-6)、白介素-8(Interleukin-8,IL-8)和缩血管物质内皮素-1(Endothelin-1,ET-1)的蛋白表达水平;利用RT-PCR法检测IL-6、IL-8、细胞间黏附分子-1(Intercellular cell adhesion molecule-1,ICAM-1)和血管细胞粘附分子-1(Vascular cell adhesion molecule1,VCAM-1)等指标m RNA的表达水平。其中ET-1、ICAM-1、VCAM-1是动脉粥样硬化样改变的早期标志指标。为进一步研究臭氧作用途径及机制,臭氧暴露前加入炎性因子IL-6或IL-8的中和抗体(Neutralizing antibody,NA)。臭氧暴露后,利用ELISA法检测ET-1蛋白的表达水平,RT-PCR法检测ICAM-1及VCAM-1m RNA的表达水平。结果1.臭氧暴露对A549细胞和HCAEC细胞的损伤作用。高浓度臭氧(200ppb、400ppb)暴露可引起单独A549细胞、单独HCAEC细胞和共培养暴露组(A549+HCAEC)LDH水平显著上升,差异有统计学意义(P<0.05)。高浓度臭氧(400ppb)暴露,共培养暴露组LDH水平较单独暴露A549细胞和HCAEC细胞显著升高,有统计学差异(P<0.05)。总之,臭氧暴露对A549细胞和HCAEC细胞均有直接损伤效应,高浓度臭氧暴露下共培养模型组细胞损伤较单独暴露组更为严重。2.臭氧暴露对A549细胞和HCAEC细胞的炎性作用。高浓度臭氧(400ppb)暴露,单独HCAEC细胞和共培养暴露组IL-6蛋白表达水平显著升高,差异有统计学意义(P<0.05)。同时,单独HCAEC细胞和共培养暴露组中HCAEC细胞IL-6m RNA表达水平较对照及中、低浓度臭氧暴露组显著升高,差异有统计学意义(P<0.05);中、高浓度臭氧暴露,共培养暴露组HCAEC细胞较单独暴露HCAEC细胞IL-6m RNA表达水平显著升高,差异有统计学意义(P<0.05)。高浓度臭氧暴露,单独A549细胞及单独HCAEC细胞IL-8m RNA表达水平显著升高,差异有统计学意义(P<0.05);中、高浓度臭氧暴露,共培养暴露组中HCAEC细胞IL-8m RNA表达水平显著升高,差异有统计学意义(P<0.05)。相同臭氧浓度暴露,单独A549细胞和共培养A549细胞IL-8m RNA表达水平较共培养暴露组HCAEC细胞及单独暴露HCAEC细胞升高,差异有统计学意义(P<0.05)。急性臭氧暴露,单独A549细胞和共培养暴露组IL-8蛋白表达水平显著升高,差异有统计学意义(P<0.05);高浓度臭氧暴露,单独HCAEC细胞IL-8蛋白表达水平显著升高,差异有统计学意义(P<0.05);相同臭氧浓度暴露,共培养组IL-8蛋白表达水平较单独A549细胞及单独HCAEC细胞均升高,有统计学差异(P<0.05)。综上所述,臭氧暴露可以引起单独A549细胞和单独HCAEC细胞发生炎症反应,共培养细胞的炎症反应较单独暴露A549细胞和单独暴露HCAEC细胞更为严重。3.臭氧暴露可引起共培养HCAEC细胞发生动脉粥样硬化样改变。高浓度臭氧暴露,单独HCAEC细胞和共培养HCAEC细胞VCAM-1m RNA表达水平显著升高,差异有统计学意义(P<0.05);中、高浓度臭氧暴露,单独HCAEC细胞ICAM-1m RNA表达水平显著升高,差异有统计学意义(P<0.05);急性臭氧暴露,共培养HCAEC细胞ICAM-1m RNA表达水平显著升高,差异有统计学意义(P<0.05)。高浓度臭氧暴露,共培养HCAEC细胞VCAM-1和ICAM-1m RNA表达水平均较单独HCAEC细胞显著升高,差异有统计学意义(P<0.05)。急性臭氧暴露,单独HCAEC细胞和共培养暴露组ET-1表达水平均显著升高,差异有统计学意义(P<0.05),且共培养暴露组ET-1表达水平较单独HCAEC细胞显著升高,差异有统计学意义(P<0.05)。综上所述,臭氧诱导共培养HCAEC细胞ICAM-1、VCAM-1和ET-1等因子的表达,表明了臭氧诱导共培养HCAEC细胞发生了动脉粥样硬化样改变。4.炎性因子在臭氧诱导共培养HCAEC细胞动脉粥样硬化样改变中的作用。由上可知,臭氧可诱导共培养模型中炎性因子IL-6、IL-8的表达,为了进一步检测两种炎性因子是否在臭氧诱导的共培养HCAEC细胞动脉粥样硬化样改变中起作用,分别将IL-6(NA)或IL-8(NA)预先加入共培养细胞培养液中,观察其对臭氧作用的影响。结果表明,在对照抗体组,臭氧暴露(400ppb)可明显增加共培养HCAEC细胞ET-1和ICAM-1的表达,与上述结果一致;加入IL-8(NA)后,臭氧所致共培养HCAEC细胞ET-1和ICAM-1的表达水平明显降低(P<0.05);加入IL-6(NA)后,臭氧所致共培养HCAEC细胞ICAM-1的表达水平明显降低(P<0.05)。结果显示,IL-6、IL-8在共培养HCAEC细胞发生动脉粥样硬化样改变的过程中发挥重要作用。结论1.臭氧暴露可以诱导共培养HCAEC细胞损伤,以及IL-6和IL-8表达升高为标志的炎性反应;2.臭氧暴露可以诱导共培养HCAEC细胞发生动脉粥样硬化样改变,表现为黏附因子(ICAM-1、VCAM-1)和ET-1表达上调3.IL-6和IL-8在臭氧所致血管内皮细胞动脉粥样硬化样改变过程中发挥重要作用。