论文部分内容阅读
本研究同时从不可培养和可培养细菌两方面入手,从重金属污染土壤中筛选抗重金属汞和镉的基因。通过功能和序列驱动筛选相结合的方法,从已构建的土壤宏基因文库中分离鉴定抗重金属汞和镉的基因。采用传统的微生物分离培养方法,从重金属污染土壤中筛选重金属汞、镉抗性细菌菌株,然后从中分离鉴定抗重金属汞和镉的基因。研究结果如下:（1）从北京凉水河床底泥中分离得到3株抗镉菌和3株抗汞菌。在含镉（CdCl2）为450μg/mL的LB平板上筛选得到3株抗镉菌,编号为KCd1、KCd2、KCd3;在含汞（HgCl2）70μg/mL的LB平板上筛选得到3株抗汞菌,编号为KHg1、KHg2、KHg3。对6株抗性菌进行了形态观察、生理生化测定、脂肪酸鉴定和16S rDNA序列分析,结果表明,6株菌中有5株为芽胞杆菌属,1株为假单胞菌属。经鉴定在分类上KHg2为Bacillus silvestris,KCd1为Bacillus cereus;KCd3为Bacillus mycoides,而其它菌株的分类地位待定。（2）扩增获得了5个抗汞的merA基因,将其克隆于PET-30（a）+,并在E.coli BL21（DE3）中得以成功表达。从分离得到的3株抗汞菌的基因组DNA中扩增分别得到1个merA基因,命名为pZY1、pZY2和pZY3,从文库中得到2个merA序列,命名为pZY4和pZY5,将5个merA基因克隆到pET-30（a）+,并转入E.coliBL21（DE3）中,分别命名为E.coli BL21（DE3）pZY1至E.coli BL21（DE3）pZY5。采用对克隆质粒扩增和对克隆质粒用BamHI和HindⅢ双酶切进行验证,结果表明merA基因成功克隆于pET-30（a）+。将克隆的merA基因在E.coli BL21（DE3）中用1 mmol/L的IPTG进行诱导表达成功;采用SDS-PAGE,探讨了温度对merA基因的诱导表达效果,结果表明37℃为最佳表达温度;在不同时段加入HgCl2,培养28h后,重组菌株生长良好,而对照不生长,表明重组质粒中含有的merA基因具有汞抗性功能。实验发现,从文库中得到的两个基因的重组菌比从抗性菌中得到的merA基因的重组菌株的生长要弱。（3）功能平板筛选得到17个在含CdCl2（150μg/mL）平板上生长良好的抗镉阳性克隆子;从抗性菌中用Nest-PCR获得3个镉抗性基因cadA的保守序列（分别为485bp、483bp和482bp）。筛选混合基因文库,在含镉150μg/mL的平板上,以空质粒PBS为阴性对照,得到17个阳性克隆子,将其中2个测序,利用GenBank中的Blastx搜索测定的序列,结果编号为Cd15的部分蛋白序列与水解酶家族中的金属依赖酰胺水解酶（metal dependent amidohydrolase）和金属依赖性甘氨酸酶（metal dependant alycoprotease）分别有56%和53%的相似性,推测可能是新的基因,其证实工作有待于进一步实验。从3个菌中得到3个长度分别为485bp、483bp和482bp的序列,测序结果经GenBank中搜索,均为cadA中的保守序列。