前言　　恶性肿瘤是严重危害人类健康的公共卫生问题，其发生发展是遗传和环境因素综合作用的结果，找寻有效的遗传生物学标志，做到早期预防和合理治疗，对于提高恶性肿瘤的生存率和生存质量具有重要意义。单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphisms，SNP)被称为第三代遗传学标记，是指由于单个碱基替换、缺失或插入等引起的DNA序列改变，从而导致相应的蛋白功能和表型发生改变。环境应答基因SNP及单体型作为目前复杂疾病的重要生物学标志，成为肿瘤易感及预后治疗研究的一个热点。DNA损伤修复基因是与恶性肿瘤相关的首类环境应答基因。　　顺铂(cisplatin，DDP)是治疗卵巢癌、肺癌等实体瘤的常用药物。铂类药物进入肿瘤细胞后与DNA结合，形成Pt-DNA加合物，导致DNA的链间或链内交链，引起DNA复制障碍，从而抑制肿瘤细胞分裂。然而近年来发现肿瘤细胞对化疗耐药的产生，严重影响了化疗疗效，导致治疗预后并不理想。对铂类药物的抵抗可以通过以下机制发生:减少药物积聚;通过共扼结合去除药物毒性;提高对铂类药物诱导产生的DNA加合物的耐受性;或者提高DNA修复能力(DNArepaircapacity,DRC)。其中，DNA损伤修复能力增强是导致肿瘤铂类耐药的主要原因之一，DNA修复途径中的核苷酸切除修复(NER)、错配修复(MRR)、碱基切除修复(BER)等均与铂类药物耐药有关，而核苷酸切除修复通路被认为是机体内修复顺铂所致DNA损伤的最主要途径。　　核苷酸切除修复交叉互补基因2，又称着色性干皮病基因D(excisionrepaircrosscomplementationgroup2/XerodermapigmentosumD，ERCC2/XPD)是核苷酸切除修复通路中的重要基因。ERCC2/XPD基因是一个多功能的基因，一方面作为解旋酶参与核苷酸切除修复途径，在铂类治疗过程中，ERCC2/XPD基因可去除铂-DNA加合物从而发挥作用;另一方面其编码的蛋白还参与组成Ⅱ型转录因子H(TFⅡH)复合物及p53介导的凋亡反应，同时还参与基础转录。研究发现ERCC2/XPD参与顺铂(cisplatin，DDP)或卡铂(carboplatin，CBP)引起的DNA损伤修复过程。ERCC2/XPD的多态性可以改变DNA损伤修复能力，与铂类药物的敏感性密切相关。分子流行病学研究显示，ERCC2/XPD751Gln/Gln型多态性与肺癌、头颈鳞癌、基底细胞癌等恶性肿瘤发生有关。在吸烟者和健康人群的研究中，751Gln/Gln型的个体DRC低，患肺癌的风险高。751Gln/Gln型的个体患头颈部癌的风险亦比Lys/Lys型组高。但以往国内也有研究结果显示ERCC2/XPDLys751Gln与肿瘤铂类药物化疗效果并不相关。这些研究结果的不同可能与ERCC2/XPD遗传多态在人群中分布频率存在差异有关。因此，以人群为基础的流行病学研究结果存在的不一致性，提示我们需要标化环境暴露因素，进行基因多态的功能研究。随着对ERCC2/XPD基因多态性与铂类药物耐药性关联的进一步研究，将有助于更深入地了解肿瘤发病的分子机制，从而在临床上为肿瘤的预防、早期诊断与基因治疗提供全新的思路。　　本研究通过构建ERCC2/XPDrs13181AA(Lys751)和ERCC2/XPDrs13181CC(Gln751)两种基因型的质粒转染中国仓鼠卵巢细胞(CHO)ERCC2/XPD缺失的突变型细胞UV5，获得稳定表达ERCC2/XPD不同基因型的转染细胞。给予顺铂处理后比较不同细胞的细胞抑制率及DNA损伤修复能力的差异;比较磷酸化p53蛋白表达在顺铂处理后的变化;检测不同细胞的细胞周期、细胞凋亡率的变化趋势，进而阐明ERCC2/XPD基因多态性、p53基因表达、细胞周期、细胞凋亡与DNA损伤修复之间的内在联系。试图为找寻意义确切的、与铂类抗肿瘤药物敏感性相关的生物学标志提供新的科学依据。　　研究方法　　1、细胞培养及处理　　中国仓鼠卵巢细胞(CHO)AA8(CHO野生型)、UV5(CHO突变型，ERCC2/XPD表达缺失):90％DMEM+10％FBS，37℃，5％CO2孵育箱培养;UV5ERCC2(AA)、UV5ERCC2(CC)、UV5GFP三株转染细胞:含有0.5-1mg/mlG418的培养基(90％DMEM+10％FBS)，37℃，5％CO2孵育箱培养。　　2、转染细胞的鉴定　　2.1转染细胞可在含0.5-1mg/mlG418的DMEM培养基中选择生长。在对数生长期时，荧光显微镜下是否可见表达绿色荧光蛋白的细胞，确定转染效率。　　2.2Westernblotting法检测ERCC2/XPD基因蛋白表达。　　2.3TaqMan(@)real-timePCR法检测ERCC2/XPDLys751Gln(rs13181)位点基因型。　　3、各细胞DNA损伤修复能力的检测　　3.1细胞抑制率实验(MTT)测定顺铂处理后细胞存活率;　　3.2彗星实验和Rad51免疫荧光实验测定顺铂所致DNA的损伤情况;　　4、使用细胞周期检测试剂盒检测顺铂所致各细胞周期的改变　　5、使用AnnexinⅤ-PE/7-AAD细胞凋亡率检测试剂盒检测顺铂所致各细胞的凋亡情况　　6、顺铂致不同细胞DNA损伤后磷酸化p53的变化　　6.1Real-timePCR测定顺铂染毒后磷酸化p53mRNA水平;　　6.2Westernblotting测定顺铂染毒后磷酸化p53蛋白表达水平;　　6.3在转录和蛋白水平上分析比较表达ERCC2/XPDLys751Gln(rs13181)位点不同基因型的转染细胞之间经顺铂染毒后诱导磷酸化p53的差异。　　结果　　1、体外转染细胞模型的验证　　1.1ERCC2/XPDrs13181AA(Lys751)、rs13181CC(Gln751)质粒以及GFP空质粒分别转染至UV5细胞，三种转染细胞可在含0.5-1mg/mlG418的DMEM培养基中选择性生长。待稳定生长至对数生长期时，荧光显微镜下检查转染效率均达到80％以上。　　1.2Westernblot鉴定各细胞中ERCC2/XPD蛋白的表达，细胞AA8与转染细胞UV5ERCC2(AA)和UV5ERCC2(CC)可表达分子量为87kD的ERCC2/XPD蛋白。　　1.3TaqMan(@)real-timePCR法验证转染细胞UV5ERCC2(AA)和UV5ERCC2(CC)的ERCC2/XPDLys751Gln(rs13181)位点基因型，分别为AA和CC。　　2、各细胞DNA损伤修复能力差异的比较　　2.1MTT实验结果显示ERCC2/XPD缺失型细胞(UV5和UV5GFP)与野生型AA8相比，对顺铂表现出较强的敏感性。而ERCC2/XPD过表达转染细胞(UV5ERCC2(AA)和UV5ERCC2(CC))则表现出与AA8相似的细胞抑制率。对于ERCC2/XPD过表达的两种转染细胞在顺铂处理24h时，8μg/ml与16μg/ml两个剂量组，细胞存活率有统计学差异(P＜0.05)。但是经过24h的恢复，1、2、4、8μg/ml顺铂处理时，UV5ERCC2(CC)的细胞存活率低于UV5ERCC2（AA），差异有统计学意义(P＜0.05)。　　2.2彗星实验结果显示ERCC2/XPD缺失型细胞(UV5和UV5GFP)与其野生型AA8相比，各浓度、各时间点均表现出更为严重的DNA损伤，差异有统计学意义（P＜0.05）。顺铂未经处理时OTM值为高峰，随顺铂染毒时间的增加，DNA损伤逐渐加重，当处理24h后继续培养24h时，ERCC2/XPD功能完善的细胞DNA损伤程度得到了明显的修复，而ERCC2/XPD缺失的细胞仍存在一定的损伤情况。转染细胞UV5ERCC2(AA)和UV5ERCC2(CC)对于DNA损伤的修复能力，在顺铂处理24h后继续培养24h时明显，但各浓度相比较，差异未见统计学意义。　　2.3Rad51免疫荧光实验结果显示两种转染细胞UV5ERCC2(AA)和UV5ERCC2(CC)的损伤细胞比例与野生型AA8接近，仅在8μg/ml顺铂处理24h时两转染细胞间有统计学差异(P＜0.05)。顺铂处理24h后继续培养24h时，损伤细胞的比例相对于24h时明显下降，但两转染细胞间差异未见统计学意义。　　3、顺铂致不同细胞的细胞周期改变　　顺铂在肿瘤治疗时常表现细胞周期的G2、M期阻滞现象。1、2μg/ml顺铂处理各细胞，可见明显的细胞周期阻滞现象。随着顺铂剂量的增加，各细胞的细胞周期阻滞越明显，阻滞的细胞比例越大，修复过程越漫长。随着时间的延长，各细胞先集中阻滞于S期，经过24h的修复，野生型AA8与两种转染细胞UV5ERCC2(AA)和UV5ERCC2(CC)有较明显的修复，细胞集中停留在G2期，但两者差异未见统计学意义。　　4、顺铂致不同细胞的细胞凋亡率差异　　顺铂处理各细胞，观察各细胞的细胞凋亡率情况。ERCC2/XPD缺失型细胞(UV5和UV5GFP)与野生型AA8相比，各浓度、各时间点均表现出更为严重的凋亡，差异有统计学意义(P＜0.05)。转染细胞UV5ERCC2(AA)和UV5ERCC2(CC)在同一浓度顺铂处理时与AA8凋亡率相近，仅在8μg/ml顺铂处理细胞24h时，两者差异有统计学意义（P＜0.05）。随着顺铂处理时间的延长，各细胞凋亡率逐渐增加，在顺铂处理24h达到高峰，继续培养24h后，细胞凋亡率显著减少，表现出一定的损伤修复能力。　　5、顺铂致不同细胞DNA损伤后磷酸化p53的变化　　3.1Real-timePCR实验结果显示顺铂处理24h时，磷酸化p53的mRNA水平达到高峰，随着染毒时间的延长，磷酸化p53的mRNA水平逐渐呈下降趋势。在8μg/ml顺铂处理24h时和处理24h后继续培养24h时，UV5ERCC2(AA)的磷酸化p53mRNA表达水平明显高于UV5ERCC2(CC)，差异有统计学意义(P＜0.05）。　　3.2Westernblot实验结果显示顺铂处理24h时，ERCC2/XPD的蛋白表达水平达到峰值。UV5ERCC2(AA)的磷酸化p53蛋白表达水平明显高于UV5ERCC2(CC)，但各浓度、各时间点未见统计学差异。　　结论　　1、本研究通过转染细胞模型发现ERCC2/XPDLys751Gln(rs13181)SNP在顺铂所致DNA损伤修复能力方面存在差异，该位点AA基因型转染细胞的损伤修复能力优于其突变型CC基因型。因此ERCC2/XPDLys751Gln(rs13181)SNP可能通过改变细胞的DNA损伤修复能力与顺铂耐药性相关联。　　2、本研究发现ERCC2/XPD不但在顺铂所致DNA损伤的核苷酸切除修复中发挥重要作用，而且对p53介导的细胞凋亡具有一定影响。ERCC2/XPDLys751Gln位点AA基因型的转染细胞中磷酸化p53mRNA水平高于CC基因型。因此推断ERCC2/XPD基因多态可能影响p53通路与顺铂耐药产生一定关联。　　3、本研究证实ERCC2/XPDLys751Gln(rs13181)SNP在体外细胞模型中与顺铂敏感性的关联，提示如能结合人群研究结论，该位点可能成为预测肿瘤患者铂类药物治疗预后的一个有效的生物学标志。