仔猪断奶易受到应激(包括断奶本身)引发肠炎的发生,导致肠道功能紊乱,造成仔猪生长阻滞。究其原因是由肠上皮屏障通透性增加,肠腔内抗原物质、细菌/内毒素入侵粘膜下免疫系统发生免疫反应所致;而紧密连接(tight junction,TJ)作为构成肠上皮结构屏障的基础,其关键蛋白的表达和结构的改变可能是肠通透性改变的根源。肌球蛋白轻链(myosin light-chain,MLC)的磷酸化引起细胞F-actin骨架系统收缩,牵拉细胞引发TJ分子结构的重排,连同TJ蛋白表达量的降低可能导致TJ结构开放,增强肠屏障的通透性。在仔猪断奶后发生肠道适应的时期,内源水平急剧降低的胰高血糖素样肽-2(Glucagon-likepeptide2,GLP-2),是具有特异性肠营养效应的肽类激素,但GLP-2对断奶仔猪肠屏障通透性的调节作用及分子机制尚不明确。因此,本研究拟通过体内试验考察外源注射GLP-2对仔猪断奶应激后生产性能的影响;在此基础上进一步考察肠屏障功能的变化,并通过体内体外试验明确GLP-2对TJ蛋白表达及分布的作用;在体外试验中,拟从蛋白磷酸化修饰、信号的核转位、胞内信号转导以及胞外信号转导等4个层面由内而外地考察可能参与GLP-2调节肠上皮TJ结构稳定的信号途径,深入而系统地揭示GLP-2调控断奶仔猪肠上皮屏障功能的分子作用机制。一、GLP-2对断奶仔猪肠道发育和生产性能的影响试验一选取28日龄断奶、体重接近、健康的“杜X长X大”三元杂交阉公仔猪40头,随机分为4个处理:对照组、LPS应激组、LPS+低剂量GLP-2组、LPS+高剂量GLP-2组,每个处理10个重复,每个重复1头猪。各处理每天分别按0、0、2、10 nmol/kg剂量皮下注射含h[Gly2]GLP-21-34的无菌PBS溶液,每天2次,连续7天。在第14天,对照组注射无菌生理盐水,其余各组按100μg/kg剂量腹腔注射含脂多糖(Escherichia coli lipopolysaccharide,LPS)的生理盐水。结果发现:高剂量GLP-2处理显著提高了十二指肠、空肠、回肠的重量、小肠总重和小肠肠重指数(P<0.05);GLP-2剂量依赖地提高了各肠段绒毛高度、绒毛高度与隐窝深度的比值(villus height/crypt depth ratio,VCR)(P<0.05);组织学分析结果显示GLP-2处理保护小肠绒毛免受LPS引起的损伤,维持了小肠绒毛的完整性;十二指肠和空肠中碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,AKP)、γ-谷氨酰转肽酶(γ-glutamyltranspeptidase,y-GT)和胰脂肪酶的活性随 GLP-2剂量的增加而显著提高(P<0.05);GLP-2显著提高了断奶仔猪0～7 d、7～14 d、0～14 d的平均日增重和增重/耗料比(P<0.05),并使高剂量GLP-2组仔猪的末重显著提高(P<0.05)。结果表明:外源注射GLP-2能促进断奶仔猪小肠发育,缓解肠绒毛应激损伤,增强肠道消化吸收酶活,进而改善断奶仔猪的生产性能。二、GLP-2对LPS应激的断奶仔猪肠粘膜屏障损伤的作用在试验一的基础上,进一步考察GLP-2处理对仔猪断奶后LPS免疫应激导致的肠粘膜屏障损伤的保护作用及可能机理。结果如下:高剂量GLP-2提高了 TJ关键蛋白zona occluden-1(ZO-1)和occludin基因和蛋白的表达(P<0.05),恢复了 TJ蛋白在肠上皮细胞间的超微结构分布,显著降低了血浆LPS 浓度、D(-)-lactate 和二胺氧化酶(diamine oxidase,DAO)活性(P<0.05),以及十二指肠和空肠粘膜的DAO酶活(P<0.05),降低了 LPS引起的促炎性细胞因子IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α的血清水平(P<0.05)和小肠各段中mRNA的表达量(P<0.05);随着GLP-2剂量的增加,GLP-2抑制了 LPS诱导的十二指肠、空肠和回肠MLCK基因和蛋白的表达以及pMLCThr18/Ser19的过磷酸化。结果表明:GLP-2可通过影响TJ蛋白的表达和分布缓解遭受LPS应激的断奶仔猪肠屏障功能的损伤以及肠炎的发生。三、GLP-2对应激的IPEC-J2肠上皮细胞间通透性的调控作用及分子机制研究(一)研究模型的建立(3个小试验)(1)IPEC-J2细胞系GLP-2R的鉴定试验通过对GLP-2R表达的鉴定,确定选用的仔猪IPEC-J2细胞系能否用于GLP-2的分子机制研究。分别采用实时荧光定量PCR法、western blot和免疫荧光染色技术对IPEC-J2细胞的GLP-2R表达和细胞定位进行检测,结果显示:IPEC-J2细胞能表达GLP-2R,且定位于细胞膜及胞浆中。(2)LPS应激模型的建立试验共设5个处理,分别研究了 0、10、50、100、150μg/mLLPS对仔猪IPEC-J2细胞系单层上皮细胞通透性的影响。结果发现:细胞单层TER随着LPS应激剂量的增加而显著降低(P<0.05),24h后HRP漏过率随LPS剂量的增加而显著增加(P<0.05),到100μg/mL剂量时达到显著水平(P<0.05),细胞活力显著下降(P<0.05),细胞形态发生明显变化,死细胞增多,但仍保持了完整的细胞单层结构;然而,当剂量达到150 μg/mL,细胞形态完全受损,边缘线条残破,细胞大量死亡以致单层结构受损。结果表明:LPS引起IPEC-J2细胞间通透性的增加;本试验确定LPS诱导IPEC-J2细胞间通透性改变的最适应激剂量应为100 μg/mL。(3)GLP-2对LPS应激的IPEC-J2细胞单层通透性的缓解作用试验共设6个处理,通过添加1×10-10～1×10-7 mol/L GLP-2处理IPEC-J2细胞1 h,再用100μg/mlLPS处理24h,考察GLP-2对IPEC-J2细胞单层通透性的缓解作用。结果发现:当GLP-2剂量达到1×10-8和1×10-7 mol/L,显著抑制了 LPS引起的TER值的降低以及HRP漏过率的增加(P<0.05),维持了正常的细胞形态,减少了细胞的死亡;与LPS组相比,细胞活力随GLP-2剂量的增加而显著提高(P<0.05),当GLP-2剂量为1×10-9mol/L时,与对照组差异不显著。结果表明:GLP-2可以缓解LPS应激增强的仔猪肠上皮细胞单层的通透性,其适宜添加剂量应为1×10-8mol/L。(二)GLP-2对LPS应激的IPEC-J2细胞TJ蛋白表达及重排的影响及MLCK/pMLC的介导作用研究(2个小试验)试验(1)共分3个处理,即对照组、LPS组和GLP-2+LPS组,考察GLP-2是否通过影响细胞TJ蛋白的表达和超微结构的分布实现在应激条件下对细胞单层通透性的调节。试验(2)使用MLCK抑制剂ML-9和GLP-2对细胞预处理1 h后,进行LPS攻毒,考察应激45 min后LPS应激是否引起MLCK/pMLC信号的活化以及24 h后TJ蛋白表达量及超微结构分布的改变,并明确MLCK/pMLC信号是否在应激起始受到GLP-2的调控,进而缓解LPS引起的TJ结构的重排。共分5个处理:对照、LPS组、GLP-2+LPS组、ML-9+LPS组、ML-9+GLP-2+LPS组。结果显示:1×10-8mol/LGLP-2显著抑制了 LPS导致的ZO-1和occludin蛋白表达量的下调(P<0.05),以及MLCK蛋白表达量和pMLCThr18/Ser19的磷酸化水平的上调(P<0.05);单独添加ML-9对LPS下调的ZO-1和occludin蛋白表达没有显著影响(P>0.05);ML-9+GLP-2促进了 TJ蛋白的表达(P<0.05)。GLP-2、ML-9 或 ML-9+GLP-2 均显著抑制了 LPS 对 pMLCThr18/Ser19 的过磷酸化(P<0.05),抑制了 LPS提高的细胞单层对HRP的漏过率(P<0.05);但是,GLP-2和ML-9+GLP-2两组的HRP漏过率均显著低于ML-9组(P<0.05)。免疫荧光染色结果显示LPS导致TJ蛋白ZO-1和occludin蛋白网状结构消失,胞浆中occludin蛋白的颗粒状分布增加;GLP-2处理缓解了LPS导致的ZO-1和occludin蛋白的定位失调,其免疫荧光呈现完整的“铁丝网”状结构,胞浆内呈颗粒状的occludin蛋白分布减少:ML-9使ZO-1和occludin蛋白在细胞膜上局部呈现网状结构分布,但是仍可见细胞边缘染色的线条断裂、不完整;ML-9+GLP-2处理使细胞间ZO-1和occludin蛋白的定位和分布恢复正常。结果表明:1)GLP-2缓解应激后肠上皮细胞间通透性的作用机制与紧密连接结构的稳定密切相关。GLP-2对紧密连接的调节涉及:①促进细胞膜上紧密连接蛋白的表达;②在应激起始取消LPS应激引起的MLC过磷酸化,进而防止TJ蛋白结构的重排;2)MLCK介导的pMLC磷酸化并不参与紧密连接蛋白表达量的调节。(三)GLP-2影响TJ屏障功能的信号途径研究通过以下4个小试验进一步考察GLP-2调节应激状态下TJ蛋白表达及超微结构分布改变的可能信号途径及其相互间的关系。(1)NF-κB的核转位在GLP-2调节MLC过磷酸化中的作用将NF-κB的抑制剂PDTC联合GLP-2预处理1 h后,进行LPS应激,考察GLP-2对MLCK/pMLC进行调节的上游途径是否经NF-κB信号所介导。试验共设5个处理:对照、LPS组、GLP-2+LPS 组、PDTC+LPS 组、PDTC+GLP-2+LPS 组。结果发现:LPS 引起了 pIKKαThr23、pIKBSer32/36的快速磷酸化,导致胞浆中IκB含量显著降低(P<0.05),激活p65NF-κB引起核转位,上调MLCK基因的转录水平(P<0.05)和蛋白的表达量,引起了 pMLCThr18/Ser19的过磷酸化;GLP-2、PDTC、PDTC+GLP-2处理均抑制LPS引起的NF-κB的活化及p65NF-κB的核转位,下调MLCK基因和蛋白的表达,缓解了 pMLCThr18/Ser19的过磷酸化。结果表明:LPS激活的NF-κB信号途径作为MLCK/pMLC的上游靶点受到GLP-2的抑制。(2)胞内ROCK/MLCP信号途径在GLP-2调节MLC磷酸化中的作用通过添加肌球蛋白轻链磷酸酶(myosin light chain phosphatase,MLCP)抑制剂Calyculin A和ROCK抑制剂Y27632(MLCP的激动剂),考察GLP-2对MLC磷酸化水平的调控是否除作用于NF-κB/MLCK外,还经由对MLCP酶活的调节进行补充。试验共设5个处理:对照、LPS组、GLP-2+LPS 组、CalyculinA+GLP-2+LPS 组、Y27632+GLP-2+LPS 组。结果显示:LPS 应激上调了 MLCP结合亚基MYPThr696的磷酸化水平,显著降低MLCP酶活(P<0.05);添加GLP-2或Y27632+GLP-2缓解了 LPS引起的MYPT1Thr696的磷酸化,显著提高了 MLCP的酶活(P<0.05),取消了 LPS引起的pMLCThr18/Ser19的过磷酸化;然而,Calyculin A+GLP-2组MYPT1Thr696的磷酸化水平高于GLP-2组,MLCP酶活显著低于GLP-2+LPS组(P<0.05);Calyculin A部分取消了GLP-2下调pMLCThr18/Ser19磷酸化的作用效果。结果表明:GLP-2可抑制LPS刺激的MYPT1Thr696的磷酸化,缓解MLCP酶活的降低,以及MLC的过磷酸化。(3)胞内MEK/ERK1/2信号途径对GLP-2调节TJ的作用通过添加MEK特异性抑制剂U0126考察MEK/ERK1/2信号途径是否参与GLP-2对紧密连接的调节。试验共设5个处理:对照、LPS组、GLP-2+LPS组、U0126+LPS组、U0126+GLP-2+LPS组。结果显示:LPS处理提高了 ERK1/2Thr202/Tyr204的磷酸化水平,下调HSP70的蛋白表达,降低了 ZO-1和occludin蛋白的表达,并通过上调MYPT1Thr96的磷酸化显著降低了 MLCP的酶活(P<0.05);U0126、GLP-2 或 U0126+GLP-2 处理均抑制 ERK1/2Thr202/Tyr204的磷酸化,但 U0126 处理对LPS提高的MYPT1Thr696磷酸化以及降低的MLCP酶活、HSP70和TJ蛋白的表达没有影响;GLP-2或U0126+GLP-2则抑制了 LPS引起的MYPT1Thr696磷酸化,使MLCP酶活显著高于LPS组(P<0.05),上调了 HSP70、ZO-1 和 occludin 蛋白的表达,;U0126、GLP-2 或 U0126+GLP-2处理均抑制了 LPS引起的NF-κB信号途径的活化,MLCK蛋白表达的上调和pMLCThr18/Ser19的过磷酸化。结果表明:LPS应激状态下,1)GLP-2独立于ERK1/2信号途径促进TJ蛋白的表达;2)GLP-2通过抑制ERK1/2信号途径抑制NF-κB/MLCK/pMLC信号途径的活化;3)GLP-2独立于ERK1/2信号途径实现对ROCK/MLCP的调节;4)GLP-2独立于ERK1/2信号途径刺激HSP70蛋白的表达。(4)细胞膜上G蛋白偶联受体介导的cAMP/PKA信号途径对GLP-2调节TJ的作用通过添加cAMP/PKA的激活剂Forskolin和抑制剂H89,考察GLP-2R偶联G蛋白介导的cAMP/PKA信号途径是否将信号从胞外传递至胞内介导GLP-2对紧密连接的调节。试验共设7个处理:对照、LPS 组、GLP-2+LPS 组、Forskolin+LPS 组、Forskolin+GLP-2+LPS 组、H89+LPS组、H89+GLP-2+LPS组。结果发现:LPS对细胞cAMP的产生及PKA活性没有影响(P>0.05),而GLP-2、Forskolin或Forskolin+GLP-2在LPS应激条件下能显著提高细胞cAMP的水平(P<0.05),提高PKA激酶的活性(P<0.05),缓解LPS引起的细胞单层对HRP漏过率的增加(P<0.05)。GLP-2、Forskolin或Forskolin+GLP-2均缓解了 LPS引起的TJ蛋白表达量的下调,提高了 HSP70的表达,并下调了 ERK1/2/IKK/NF-κB/MLCK和ROCK/MLCP信号途径关键激酶的磷酸化,维持了 MLCP的酶活和pMLCThr18/Ser19的正常磷酸化水平;H89、H89+GLP-2处理对LPS应激的细胞单层通透性的变化没有影响,H89取消了 GLP-2对相关信号激酶的调控作用。结果说明:LPS应激条件下,GLP-2激活了 G蛋白偶联受体介导的cAMP/PKA信号旁路,促进了 HSP70和TJ蛋白的表达,通过抑制ERK1/2/IKK/NF-κB/MLCK信号旁路缓解LPS引起的MLC的过磷酸化,并通过抑制ROCK介导的MYPThrr696磷酸化提高MLCP的酶活,实现对MLC去磷酸化过程的调节。综上所述,外源注射10nmol·kg-1·d-1GLP-2能改善断奶仔猪的生产性能,这与其促进断奶仔猪小肠发育,增强肠道消化吸收相关的酶活,缓解应激对肠屏障功能损伤以及肠炎的发生有关;GLP-2对肠屏障功能的保护作用机制与其改善TJ蛋白ZO-1和occludin的表达和分布有关;对于肠上皮细胞(IPEC-J2)间通透性的调节,GLP-2在应激起始抑制MLC的过磷酸化防止细胞间TJ结构因为F-actin骨架收缩而发生重排,并可刺激TJ蛋白的表达,维持TJ结构在胞间的正常分布与稳定;GLP-2对MLC磷酸化水平的调控,一方面通过抑制ERK1/2/IKK/NF-κB途径下调MLCK基因转录和蛋白的表达,缓解MLC的过磷酸化,另一方面通过抑制ROCK/MYPTThr96磷酸化提高MLCP酶活,增强MLC的去磷酸化;GLP-2对以上信号途径的调节以及对TJ蛋白表达的促进作用均由cAMP/PKA信号途径所介导。