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几丁质酶是昆虫蜕皮过程中极为重要的参与者与调控者,其正常的代谢对于昆虫生长发育具有至关重要的作用。囊泡病毒作为一种具有较大生防潜力的昆虫病毒,已有研究表明其会造成宿主幼虫生长历期延长、蜕皮困难、无法化蛹的现象。这些现象指示着宿主幼虫几丁质酶的代谢极有可能受到了囊泡病毒的影响。基于此,本研究以期通过对甜菜夜蛾转录组数据的筛选,获得在宿主幼虫感染烟芽夜蛾囊泡病毒3h株(Heliothis virescens ascovirus 3h,HvAV-3h)后显著差异表达的几丁质酶基因。然后通过对HvAV-3h感染和模拟感染幼虫几丁质酶活性及转录、表达模式的分析,从而探明HvAV-3h对宿主几丁质酶的调控,主要研究结果如下:1、甜菜夜蛾几丁质酶基因的克隆与系统发育分析:基于已报道的甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)转录组数据,经过筛选和RT-PCR验证最终获得了HvAV-3h感染后显著差异表达的5个几丁质酶基因(S.exigua chitinase,SeCHIT)和1个几丁质结合域基因(S.exigua chitin-binding domain,SeCBD)。通过分子特征和系统发育分析结果表明:这5个SeCHIT分别命名为SeCHIT7、SeCHIT11、SeCHIT12、SeCHIT13和SeCHIT14,其中SeCHIT7属于III型几丁质酶,而SeCHIT11、SeCHIT12、SeCHIT13和SeCHIT14属于VIII型几丁质酶。2、甜菜夜蛾几丁质酶的原核表达及其多克隆抗体的制备:通过大肠杆菌表达系统成功表达获得了SeCHIT7N(SeCHIT7的N端)、SeCHIT11、SeCHIT12和SeCBD的纯化蛋白,并测定了其活性。结果表明:SeCHIT7N的几丁质酶活性>SeCHIT11>SeCHIT12,而SeCBD无几丁质酶活性。但是SeCBD的存在可以提高3个SeCHIT的几丁质酶活性。最后获得了特异性较高的SeCHIT7N、SeCHIT11和SeCBD的多克隆抗体。3、HvAV-3h对甜菜夜蛾几丁质酶活性影响的检测:测定了健康甜菜夜蛾不同发育阶段和不同组织中几丁质酶的活性,结果表明:从卵到1龄幼虫几丁质酶活性升高了9.4倍。4龄和5龄幼虫的几丁质酶活性高于1龄、2龄、3龄幼虫,蛹中几丁质酶活性最高(113.77 Unit)。在4个组织中酶活性高低依次为:脂肪体>表皮>中肠>血淋巴。通过比较HvAV-3h感染和模拟感染幼虫不同发育时间和不同组织中几丁质酶的活性,结果表明:在HvAV-3h感染48、72、96、120、144、168 h后,感毒幼虫的几丁质酶活性分别为模拟感染幼虫的13.20%、6.37%、5.63%、10.49%、11.79%和7.94%。在4个组织中,HvAV-3h导致宿主几丁质酶活性在168 hpi显著低于模拟感染幼虫,分别降低了87.95%(血淋巴)、96.96%(脂肪体)、76.84%(中肠)和95.86%(表皮)。4、HvAV-3h对甜菜夜蛾几丁质酶转录、表达影响的检测:通过荧光定量PCR和Western blot的方法检测了健康幼虫不同发育阶段和不同组织中3个SeCHIT(SeCHIT7、SeCHIT11和SeCHIT12)的转录、表达水平。结果表明:SeCHIT7在5龄幼虫体内检测到最丰富的转录本;SeCHIT11和SeCHIT12在幼虫期表现出相似的转录模式,即从1龄幼虫到3龄幼虫转录水平逐渐升高,随后降低;SeCHIT11在卵中转录水平最高,而SeCHIT12在蛹中转录水平最高。在4个组织中,3个SeCHIT的转录均可被检测到,其中主要在中肠中转录,其次是脂肪体。然后通过比较HvAV-3h感染和模拟感染幼虫不同发育时间全虫中3个SeCHIT的转录水平,发现HvAV-3h导致SeCHIT7在6、9、12、48、72和96 hpi的转录水平显著降低,而SeCHIT11和SeCHIT12在3-96 hpi的转录水平降低;在120-168 hpi,3个SeCHIT的转录水平均显著升高。其中SeCHIT7在96 hpi下降了99.94%,而在120 hpi比模拟感染的幼虫高1300倍以上;与模拟感染幼虫相比,在感毒幼虫体内SeCHIT11的转录水平在6 hpi降低了99.98%,而在168 hpi增加了25.15倍;SeCHIT12的转录水平在6 hpi被HvAV-3h完全抑制,而在120 hpi升高了40.10倍。在不同组织中的转录分析表明HvAV-3h显著影响了3个SeCHIT在甜菜夜蛾幼虫血淋巴、脂肪体、中肠和表皮中的转录模式,特别是SeCHIT7在脂肪体和表皮中的转录以及SeCHIT12在脂肪体中的转录被显著抑制。本研究首先获得了HvAV-3h感染引起显著差异表达的5个甜菜夜蛾几丁质酶基因,并对其分子特征进行了分析描述,然后比较了HvAV-3h感染与模拟感染幼虫体内几丁质酶的活性差异,最后对SeCHIT7、SeCHIT11和SeCHIT12等3个基因的转录、表达进行了时空特异性分析,从而揭示HvAV-3h对甜菜夜蛾几丁质酶的调控机制,最终为HvAV-3h致病机制的研究奠定了一定的基础。