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牛结核病(Bovine Tuberculosis,bTB)主要是由牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis,M.bovis)感染引起的一种全球范围内流行的慢性传染病,牛分枝杆菌主要感染宿主是牛,偶尔感染其他哺乳动物,也能通过吸入气溶胶或摄入未经高温消毒的奶制品感染人类。牛结核病给畜牧业带来严重的经济损失,同时也严重威胁人类的生命和社会稳定。因此,寻找敏感性高、特异性好的牛结核病诊断方法是防控及根除牛结核病的重要手段之一。本试验用PCR方法从牛结核分枝杆菌AF2122/97基因组中扩增出ESAT6、CFP10、MPB83和FixB基因片段,构建pET-32a-ESAT6、pET-28a-CFP10、pET-28a-MPB83和pET-28a-FixB重组质粒,克隆到DH5ɑ感受态细胞,然后提取测序正确的阳性重组质粒,转化BL21(DE3)感受态细胞,用1mmol/L IPTG于37℃诱导表达,SDS-PAGE分析重组蛋白ESAT6、MPB83和FixB以包涵体形式存在,重组蛋白CFP10以可溶形式存在,分子质量依次约为27.8kD、28kD、37kD和16.4kD。Western-blot分析鉴定四个重组蛋白均具有良好的抗原作用,并用Ni-NTA层析柱成功洗脱出四个目的蛋白。同时本实验以ESAT6、CFP10、MPB83和FixB为包被抗原,方阵滴定确定ESAT6-ELISA、CFP10-ELISA、MPB83-ELISA和FixB-ELISA抗原最适包被浓度依次为0.3125μg/mL、0.3125μg/mL、0.625μg/mL和0.625μg/mL,血清最适稀释倍数均为1:100,酶标抗体最适工作浓度均为1:5000,以纯化的ESAT6/CFP10、ESAT6/CFP10/MPB83和ESAT6/CFP10/MPB83/FixB混合蛋白为诊断抗原,混合包被时以各自最适条件等比例混合,应用PPD-ELISA、ESAT6/CFP10-ELISA、ESAT6/CFP10/MPB83-ELISA、ESAT6/CFP10/MPB83/FixB-ELISA方法,对112份确诊的牛结核阳性血清和71份健康牛血清进行检测,评价四种检测方法的敏感性、特异性及总符合率。结果显示,三种方法的敏感性虽然低于PPD-ELISA,但特异性显著高于PPD-ELISA,与临床分菌结果有较好的符合率。因此,三种“鸡尾酒”抗原可以考虑作为新型的诊断抗原用于牛结核病的防治与诊断。