论文部分内容阅读
背景与目的肿瘤细胞的耐药机制涉及关键基因的遗传学及表观遗传学调控异常。MicroRNA(miRNA)可在转录后水平上抑制靶基因翻译,从而实现对基因表达的负性调控,广泛影响不同的分子信号通路,参与对细胞生长、分化、凋亡及肿瘤细胞恶性表型等的调控。本研究旨在探寻miRNA对人肺腺癌细胞化疗敏感性的调节作用,利用体内、外模型及临床组织标本,从细胞增殖、凋亡和细胞周期等方面探讨miR-200b参与调节人肺腺癌细胞多西他赛敏感性的可能机制及相关分子通路。材料与方法1.光镜下观察人肺腺癌SPC-A1细胞及其多西他赛耐药SPC-A1/DTX细胞的形态差异;MTT法测定二者对多西他赛敏感性差异;克隆形成实验测定二者体外增殖能力差异;流式细胞术检测二者细胞周期及凋亡率差异。2.利用高通量miRNA芯片技术,筛选SPC-A1及SPC-A1/DTX细胞的miRNA差异表达谱,对结果进行荧光实时定量RT-PCR(real-time RT-PCR)验证。3.选定miR-200b为研究对象,通过合成pri-miR-200b基因表达载体(pPG/miR-200b)和单链抑制物(miR-200b inhibitor)并分别转染人肺腺癌SPC-A1/DTX、SPC-A1、A549细胞,人为改变细胞内miR-200b表达水平,MTT法测定细胞对多西他赛敏感性差异;克隆形成实验测定细胞体外增殖能力差异;流式细胞术检测细胞周期及凋亡率差异。4.将SPC-A1/DTX分别转染空质粒对照(pPG/NC)和pPG/miR-200b后建立裸鼠皮下移植瘤模型,成瘤后定时给予多西他赛腹腔注射并绘制肿瘤生长曲线,适时处死动物后取瘤体组织,real-time RT-PCR检测miR-200b及E2F3表达水平差异,免疫组化染色检测增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)阳性率差异。5.利用三个不同的miRNA靶基因在线分析软件:①TargetScanHuman 6.0(http://www.targetscan.org/)、② DIANA-microT v3.0(http://diana.cslab.ece.ntua.gr/microT/)、③ Microrna.org(http://www.microma.org/microma/home.do),对miR-200b可能结合的靶基因进行生物信息学预测分析,对结果进行双荧光素酶报告基因实验验证。6.选定E2F3为miR-200b候选靶基因,通过合成其小干扰RNA(siRNA/E2F3)并转染SPC-A1/DTX细胞,人为下调细胞内E2F3表达水平,MTT法测定细胞对多西他赛敏感性差异;克隆形成实验测定细胞体外增殖能力差异;流式细胞术检测细胞周期及凋亡率差异。7.选取53例使用过包含多西他赛化疗方案的晚期肺腺癌患者的肿瘤组织样本,通过real-time RT-PCR检测组织中miR-200b和E2F3表达情况,结合临床信息分析与临床预后的关系。8.利用CpG岛在线预测软件MethPrimer(http://www.urogene.org/methprimer/indexl.html)搜索和分析pri-miR-200b基因转录起始位点附近2000 bp范围内的CpG岛。9.分别以不同浓度的DNA甲基转移酶特异性抑制剂5-氮杂-2’-脱氧胞苷(5-Aza-2’-deoxycytidine,5-Aza-CdR)和/或组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素A(trichostatin A,TSA)处理SPC-A1/DTX细胞,real-time RT-PCR 比较miR-200b表达水平差异。10.利用甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR，MSP),比较5-Aza-CdR处理前后SPC-A1和SPC-A1/DTX细胞中pri-miR-200b基因转录相关CpG岛的甲基化状态差异。结果1.与亲本SPC-A1细胞相比,SPC-A1/DTX细胞的体积较大,呈不规则多边形,细胞融合前具有较多细长的伪足。SPC-A1/DTX细胞对多西他赛呈现较高的耐药性(耐药指数约13.06),细胞体外增殖能力明显强于亲本SPC-A1细胞(p<0.01),细胞周期中S期比例明显增多、G1和G2/M期比例均减少(p<0.01),但细胞早期凋亡率与亲本细胞无明显差异(p>0.05)。2.在差异表达倍数≥2条件下,SPC-A1/DTX细胞较亲本SPC-A1细胞存在高表达和低表达的miRNA各8条,其中下调最为显著的是miR-200b(约12.41倍)。Real-timeRT-PCR亦证实了这一结果(p<0.01)。3.在SPC-A1/DTX和A549细胞中人为上调miR-200b表达水平后,细胞对多西他赛敏感性显著提高(p<0.01),细胞体外增殖能力下降(p<0.01),细胞早期凋亡率增加(p<0.01),细胞周期中S期比例减少(p<0.01)并出现显著的G2/M期阻滞(p<0.01);相反,在SPC-A1和A549细胞中人为下调miR-200b表达水平后,细胞对多西他赛敏感性显著降低(p<0.01),SPC-A1细胞体外增殖能力下降(p<0.05)。4.在裸鼠移植瘤模型中,人为上调miR-200b表达水平并给予多西他赛化疗可协同抑制SPC-A1/DTX细胞的成瘤能力,显著增加肿瘤细胞对多西他赛治疗的反应性,并诱导瘤体组织内PCNA表达降低,提示细胞增殖能力受阻。5.转录因子E2F3的mRNA 3’-非翻译区(3’-untranslated region,3’-UTR)第2436-2442、2857-2863碱基位置含有2个潜在的miR-200b结合位点,提示E2F3是miR-200b的候选靶基因。双荧光素酶报告基因实验亦证实了这一结果。6.在SPC-A1/DTX细胞中人为下调E2F3表达水平,可显著增加细胞对多西他赛的敏感性(p<0.01),抑制细胞增殖能力(p<0.01),有效减少细胞周期中S期比例(p<0.01)并诱导G1期(p<0.01)和G2/M期(p<0.05)阻滞,但细胞早期凋亡率无明显变化(p>0.05)。7.在肺腺癌临床组织样本中,miR-200b的表达水平与患者化疗敏感性(采用Spearman等级相关分析,rho=0.77,p<0.01)及总生存期(overall survival,OS)(采用Kaplan-Meier生存曲线分析,p<0.01)均存在正相关关系,而与E2F3 mRNA表达水平负相关(采用Spearman等级相关分析,rho=-0.68,p<0.01)。8.Pri-miR-200b编码基因定位于染色体chr1:1091347-1093441区域,转录起始位点为1092347-1092441(长度95 bp),其上、下游各1000 bp范围内共含有2个CpG岛(设定CpG岛跨度至少为200 bp,GC含量>50%,CpG出现频率>0.6),分别定位于染色体chrl:1091347-1093441 区域的 1092338-1092544(长度207 bp)和 1093091-1093389(长度299 bp)处。9.以5-Aza-CdR和/或TSA处理SPC-A1/DTX细胞后,miR-200b表达水平均较未处理组有显著提高(p<0.01)。提示肺腺癌细胞中miR-200b表达受到DNA甲基化和/或组蛋白乙酰化等表观遗传机制调控。10.在SPC-A1/DTX细胞及亲本SPC-A1细胞中,pri-miR-200b转录相关区域CpG岛均呈现完全甲基化状态。给予足够浓度的5-Aza-CdR处理后,CpG岛甲基化程度较处理前无明显变化。提示SPC-A1/DTX细胞中miR-200b表达下调并非由pri-miR-200b基因DNA甲基化的直接作用引起。结论与意义1.MiR-200b可在体内、外对肺腺癌细胞产生显著的多西他赛化疗增敏作用,同时伴有细胞增殖受阻、凋亡增加,以及细胞周期分布的明显变化。2.MiR-200b对肺腺癌细胞的化疗增敏作用可能是藉由对转录因子E2F3的负性调控进而影响细胞周期分布而实现的。3.DNA甲基化和/或组蛋白乙酰化可能是表观遗传机制参与调控耐药肺腺癌细胞miR-200b表达下调的重要方式。4.首次探讨了 miR-200b/E2F3功能轴在人肺腺癌中的表达紊乱及其与化疗敏感性的关系,并初步探讨了 miR-200b在肺腺癌耐药细胞中表达下调的可能原因。提示miR-200b有望成为临床逆转肺腺癌化疗耐药的一个新型分子靶点。