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肿瘤靶向治疗是当前癌症治疗的主要研究方向,以端粒酶为靶点的治疗方法是其中的热点之一。目前,靶向端粒酶的治疗主要集中在基因治疗、免疫治疗和小分子抑制剂等方面,还没有直接靶向端粒酶的蛋白抑制剂的报道。LP基因是本实验室克隆的一个肝癌候选抑癌基因,所编码的蛋白具有很强的端粒酶抑制活性,研究表明,把LP基因转入细胞后,能抑制端粒酶阳性癌细胞的生长。考虑到基因治疗在操作复杂性和生物安全性等方面的局限,我们尝试直接向细胞内递送LP蛋白或者其活性片断,在蛋白水平实现端粒酶的表型敲除,详细检测了LP蛋白在体内和体外对肝癌细胞生长的抑制作用,分析了它在癌症治疗中的应用前景。
首先,我们借鉴穿膜肽的最新研究成果,将LP蛋白C端196氨基酸与高效穿膜肽TAT(47～57)连接,从而构建一种新的融合蛋白--TAT-LPC。研究结果表明TAT能携带端粒酶抑制剂LPC蛋白进入癌细胞,进而进入细胞核,为这一抑制肿瘤生长新策略的可行性提供了直接的实验依据。
同时,我们初步建立了一个高效,大量制备TAT-LPC蛋白的分离纯化工艺,即“离子交换-分子筛层析”两步法,这为研究其药效学功能奠定了基础。
然后,我们在细胞水平上,详细分析了TAT-LPC蛋白在体外对肿瘤细胞生长的影响。研究结果表明,TAT-LPC能选择性作用于端粒酶阳性癌细胞,抑制它们的生长和增殖活性(生长曲线和MTT实验),使端粒缩短(SouthernBlot实验),并诱导细胞衰老和凋亡(FCM实验,细胞和细胞核形态检测),最终使细胞死亡。这种抑制作用对所有受检端粒酶阳性癌细胞都有效(普遍性),但是有滞后效应；对不同种类的细胞,抑制效果又有差别(差异性)；同时,在10μg/mL～40μg/mL剂量范围内,还具有一定剂量效应。
最后,我们在动物水平上证实TAT-LPC蛋白不仅能够降低肝癌BEL-4704细胞的致瘤性,而且能够在体内抑制肝癌BEL-4704细胞的生长,有效给药剂量为20mg/Kg,给药方式为尾静脉注射。一个重要的发现是,肿瘤移植的裸鼠体内后,立即注射TAT-LPC蛋白,给药一周后,肿瘤的生长就开始受到抑制,没有端粒酶抑制剂的滞后效应,初步分析认为TAT-LPC蛋白可能会抑制癌细胞的侵润(体外实验表明TAT-LPC能降低细胞的聚集能力)。急性毒性实验表明TAT-LPC蛋白的半数致死剂量(LD50)约为225mg/Kg,远远大于抑制肿瘤生长的有效给药剂量。
总之,我们构建和制备的TAT-LPC蛋白能在体外和体内靶向性的抑制肝癌细胞的生长,诱导细胞衰老和凋亡,证明TAT-LPC蛋白是一个肝癌靶向治疗的候选药物。