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沙门氏菌鞭毛素蛋白(flagellin)是沙门氏菌的重要结构蛋白，是一种独特的病原相关分子模式(pathogen associated molecular patterns，PAMPs)，它可以被胞外的Toll样受体5(Toll-like receptor5，TLR5)和胞内的NAIP5/NLRC4(NLRfamily CARD domain containing4，NLRC4)所识别，产生不同的细胞因子，进而影响获得性免疫应答。另外，鞭毛素蛋白作为佐剂可以诱导系统较强的抗原特异性的抗体应答和T细胞应答，以及作为黏膜佐剂增强黏膜IgA抗体水平。但是TLR5和NLRC4通路的激活在诱导flagellin特异性免疫应答方面的作用及其对鞭毛素蛋白佐剂效应的影响尚不明确。 本论文首先比较了沙门氏菌鞭毛素蛋白激活TLR5通路和NLRC4通路诱导的鞭毛素特异性的免疫应答的差异。我们根据鞭毛素蛋白识别TLR5和NLRC4通路的关键氨基酸位点，构建并表达纯化了如下不同通路活性的鞭毛素蛋白突变体:FliCΔ90-97（缺失TLR5通路活性），FliC-L3A（缺失NLRC4通路活性）和FliCΔ90-97∶L3A(TLR5和NLRC4双通路活性缺失)。用SDS-PAGE、Western-blotting、鲎试剂检测等方法验证重组鞭毛素突变体蛋白的分子量、纯度、以及合格的内毒素残留量（低于0.01EU/μg）之后，我们分别用体外实验包括Caco-2细胞系和原代腹腔巨噬细胞检测以及小鼠体内实验验证了重组蛋白激活TLR5和/或NLRC4通路的相关生物学活性。而且发现重组鞭毛素突变体蛋白通过TLR5通路介导小鼠产生MCP-1、IL-6和KC等细胞因子，通过NLRC4通路介导IL-18的产生。 进一步用不同通路活性的重组鞭毛素突变体蛋白免疫小鼠，结果显示无论单独激活NLRC4或TLR5通路都可以产生特异抗体应答，但是TLR5通路介导的抗体应答强于NLRC4通路。令人惊奇的是，我们发现缺失NLRC4通路活性的FliC-L3A蛋白能诱导产生比具有两个通路活性的野生型FliC更高的特异抗体应答。通过更深入的探究其原因，我们通过体内和体外实验发现FliC和FliC-L3A对脾脏DC的激活程度一致。但是，FliC能够激活腹腔巨噬细胞NLRC4通路，并诱导IL-18和IL-1β等细胞因子的产生，而FliC-L3A则不能。因此，我们推测巨噬细胞NLRC4通路的激活减弱了FliC诱导的鞭毛素特异性抗体免疫应答。为了证明这一推测，我们利用氯膦酸二钠脂质体(Clodronate Liposomes，Clo-LP)进行小鼠巨噬细胞清除，并利用这一巨噬细胞清除的小鼠模型平行进行了重组鞭毛素突变体蛋白的免疫实验。结果显示当小鼠巨噬细胞降至相同的水平，FliC和FliC-L3A则诱导产生相同水平的抗体应答。以上实验结果揭示了巨噬细胞NLRC4通路的激活会减弱TLR5介导的鞭毛素特异性抗体免疫应答。 另外，我们利用p24蛋白作为模式抗原，不同重组鞭毛素突变体蛋白作为佐剂，通过小鼠腹腔注射途径的免疫实验我们进一步发现了FliC-L3A同样诱导比FliC更强的抗原特异性的免疫应答水平。滴鼻途径的免疫实验发现了FliC-L3A和FliC在诱导血清的p24特异性的IgG及各亚型的抗体水平上并无明显差异，而肺洗液和肠道研磨液等黏膜部位中p24特异性的IgA抗体水平是FliC-L3A组高于FliC组。这说明了NLRC4通路减弱鞭毛素蛋白TLR5通路介导的鞭毛素蛋白的IgG抗体应答在腹腔注射途径中更为明显。 鞭毛素蛋白作为佐剂独特的优势就是可以与蛋白抗原融合而表现出比混合方式更好的佐剂效果。为了比较重组鞭毛素融合蛋白的佐剂效应，我们构建了下列融合蛋白:FliC-p24、FliC-L3A-p24、FliCΔ90-97-p24和FliCΔ90-97∶L3A-p24。首先鉴定了融合蛋白激活TLR5通路和NLRC4通路的生物学活性，然后我们比较了滴鼻免疫途径诱导的系统和黏膜抗体应答，结果显示融合蛋白缺失TLR5激活表现的佐剂效果最弱，而且FliC-L3A-p24诱导血清中的p24特异性的IgG和IgG1抗体的能力要强于FliC-p24。而且腹腔注射途径FliC-L3A-p24较FliC-p24诱导更强的CD4+和CD8+T细胞应答。 本研究揭示了NLRC4通路的激活减弱了TLR5通路介导的获得性免疫应答，加深了我们对TLR5和NLRC4通路相互影响的理解，这为我们今后在疫苗设计中合理利用鞭毛素蛋白作为佐剂提供依据，同时也为我们设计以鞭毛素蛋白为基础的沙门氏菌疫苗来抵御沙门氏菌感染提供策略。