论文部分内容阅读
背景与目的:卵巢癌(Ovarian Carcinoma,OvCa)是妇科常见的恶性肿瘤,其发病率仅次于子宫颈癌和子宫内膜癌,死亡率位居女性生殖道肿瘤的首位。由于卵巢癌早期临床症状不明显且缺乏特异性,临床大部分患者一经诊断已为临床晚期,而失去根治的机会。目前,肿瘤减灭术联合铂类药物化疗仍为卵巢癌一线治疗方案。由于传统的化疗策略疗效有限,迫切需要新的潜在的治疗靶标。有研究基于免疫组化和生物信息学分析方法初步报道了异常纺锤体样小脑相关蛋白(Abnormal spindle-like microcephaly-associated protein,ASPM)与卵巢癌之间的关系。然而,ASPM在卵巢癌细胞发生、发展中的潜在作用及其分子机制仍有待进一步阐明。因此,本研究综合利用在线数据库、生物信息学分析、临床资源和细胞实验,进一步探讨ASPM在卵巢癌进展中的作用及分子机制。研究方法:1、在线数据库及生物信息学分析:本研究使用在线数据库网站(Gene Expression Profiling Interactive Analysis(GEPIA 2.0),Cbioportal和Kaplan-Meier Plotter)分析ASPM在卵巢癌组织的表达,并探讨其在卵巢癌患者中的预后价值。同时下载并整合GEO数据库中7个GEO卵巢癌数据集(GSE6008、GSE18520、GSE26712、GSE27651、GSE29450、GSE36668、GSE52037)进行ASPM差异表达meta分析。2、临床资源免疫组化分析:为了检测ASPM在临床卵巢癌组织中的表达,我们购买80例临床卵巢癌组织芯片(75例上皮性卵巢癌(Epithelial ovarian cancer,EOC)组织和5例相邻的正常卵巢组织)进行免疫组化染色并分析ASPM表达水平与EOC临床病理特征之间的关系。3、细胞表型分析:利用两种靶向ASPM小干扰RNA(siRNA)构建EOC细胞模型(A2780和OVCAR3)中进行各种与肿瘤发生有关的细胞功能实验,包括CCK8实验、Ed U实验、集落形成实验和Transwell侵袭与迁移实验,观察ASPM在卵巢癌细胞表型中的作用。最后使用western blot检测上皮向间质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)相关蛋白的表达水平。4、ASPM调控卵巢癌细胞下游分子机制分析:下载TCGA卵巢癌表达谱数据,依据ASPM表达量的中位数分成高低表达组,进行差异表达分析并获取差异表达基因(Differentially expressed genes,DEGs),将DEGs进行京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析,以确定ASPM参与卵巢癌发病的下游信号通路。流式细胞术分析细胞周期分布以验证该通路。5、ASPM调控卵巢癌细胞增殖的上游调控分子分析:根据生物信息学预测网站(Targetscan)对ASPM上游mi RNA进行预测。设计并应用特异性mi RNA mimics和inhibitors转染细胞,分别运用q-PCR及western blot检测mi RNA与ASPM蛋白的表达水平。构建ASPM 3,-UTR野生型及突变体,利用荧光素酶报告基因实验验证miR-1284与ASPM mRNA的直接靶向调控关系。细胞增殖阻断实验进一步评估mi R-1284与ASPM m RNA的负性靶向调控关系。研究结果:1、基于在线网站GEPIA 2.0进行基因差异表达分析表明ASPM在卵巢癌中的表达明显高于正常卵巢组织(log2FC截值>1,P<0.05),且ASPM在卵巢癌高表达体现在以体细胞拷贝数三倍体和扩增为主。基于Kaplan-Meier Plotter网站行生存分析,ASPM表达较高的卵巢癌患者的总生存期(OS)(HR=1.18,P=0.013)和无进展生存期(PFS)(HR=1.21,P=0.0026)更短。7个GEO卵巢癌数据集ASPM表达差异meta分析提示,卵巢癌组织中ASPM的表达水平明显更高,且差异具有统计学意义(SMD=1.40,95%CI=0.98-1.82)。2、组织芯片的ASPM免疫组化(Immunohistochemistry,IHC)分析表明,临床分期和病理分级较高的样本具有较高的ASPM表达IHC评分(P<0.001),且ASPM在卵巢癌组织中高表达,并与较高的病理分期、等级和淋巴转移阳性有关(P<0.05),而与患者年龄无关。对浆液性腺癌进行亚组分析同样提示,ASPM在浆液性腺癌的表达与较高的病理分期、等级和淋巴转移阳性有关。3、细胞表型实验(CCK-8、EdU、克隆形成和Transwell侵袭与迁移实验)证实,与阴性对照组相比,通过小干扰RNA(si RNA)敲减ASPM后明显抑制了两种卵巢癌细胞(OVCAR3和A2780)的增殖、侵袭及迁移能力,且差异具有统计学意义(P<0.05)。同时对EMT相关蛋白进行western blot检测,结果显示,干扰ASPM表达抑制了N-cadherin蛋白的表达,增强了E-cadherin蛋白的表达。4、ASPM差异表达基因KEGG通路富集显示ASPM可能通过潜在的细胞周期相关基因调控细胞周期通路(FDR<0.05,P<0.001,normalized enrichment score=3.5371)。流式细胞术提示,沉默ASPM可以通过合成(S)期停滞抑制卵巢癌细胞的增殖(p<0.05)。5、基于生信预测网站Targetscan预测到miR-1284可能是ASPM上游的调控候选mi RNA。荧光素酶报告基因实验证实mi R-1284能与靶基因ASPM 3’UTR特异性结合,而抑制其表达,但不能与靶基因ASPM 3’UTR突变体结合,不能抑制其突变体表达。A2780细胞增殖表型阻断实验进一步证实mi R-1284抑制卵巢癌的增殖表型依赖于对ASPM的负性表达调控。结论:1、ASPM在卵巢癌组织中明显高表达,且其高表达与卵巢癌患者不良预后有关;2、ASPM通过调控细胞周期促进卵巢癌细胞增殖、侵袭及迁移。3、miR-1284可通过靶向ASPM mRNA的表达介导细胞周期抑制卵巢癌的增殖。4、ASPM可能成为抗上皮性卵巢癌有价值的潜在治疗靶标。