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依博素是从链霉菌139发酵产物中获得的新天然产物,已获国家发明专利。临床前研究已完成,正在申报治疗类风湿性关节炎(RA)的临床研究。药效学实验结果表明,依博素对类风湿性关节炎动物模型(大鼠佐剂型关节炎模型和大鼠II型胶原性关节炎模型)具有显著抑制作用,在依博素的作用下两种模型动物的IL-1β和TNFa分泌水平均显著下降,上述结果说明依博素对类风湿性关节炎的抑制作用可能和降低上述炎症细胞因子相关。类风湿性关节炎是自身免疫性疾病,严重影响人类健康,目前尚缺乏有效治疗手段。研究表明炎症细胞因子白细胞介素1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子a (TNFa)和白细胞介素6(IL-6)在类风湿性关节炎的病理过程中起重要作用,抑制其分泌表达并降低其生物活性已成为研制治疗RA新药的主要途径。为了确定依博素治疗类风湿性关节炎的作用机理,本论文在细胞水平开展了其对炎症细胞因子IL-1β、IL-6及TNFα分泌表达及信号传导途径的作用。本课题从Ⅱ型胶原诱导的类风湿性关节炎模型(CIA)大鼠,成功分离获得滑膜细胞株(FLS),建立了细胞培养条件；采用该细胞株及人急性单核细胞白血病细胞株(THP-1)开展了本项研究。在CIA-FLS细胞和THP-1细胞中,采用荧光标记底物,分别证明了依博素对IL-1β转化酶(ICE)和TNFa转化酶(TACE)活性的抑制作用；采用实时定量PCR (real-time PCR)确定了依博素对上述炎症细胞因子mRNA表达水平的降低作用；利用酶联免疫吸附方法(ELISA)及Western blotting检测,证明依博素对3种炎症细胞因子的抑制作用,上述结果证明依博素分别作用各细胞因子基因转录水平和转录后蛋白水平,从而抑制了上述细胞因子的分泌表达。在CIA-FLS细胞中,研究了依博素对炎症细胞因子IL-1β、IL-6及TNFa信号传递途径的作用。Western blotting检测表明,依博素通过降低磷酸化p38、JNK1和JNK2蛋白水平,分别抑制IL-1β和1NFa的MAPK/AP-1信号传导途径；采用Western blotting分析显示,依博素抑制磷酸化IKKa和IKKβ、磷酸化IκB和细胞核NF-κB的蛋白水平；凝胶迁移实验(EMSA)证明依博素可有效抑制细胞核NF-κB与DNA的结合；采用免疫荧光检测法证明依博素对NF-κB进入细胞核有明显抑制作用,上述实验分别证明依博素对IL-1β和TNFa的IKK/NF-κB信号传导途径抑制作用显著。采用Western blotting分析方法,确定了依博素能有效降低细胞磷酸化JAK2、STAT1和STAT3蛋白水平,免疫荧光检测法表明其对STAT3进入细胞核有一定的抑制作用,上述实验证明了依博素能抑制IL-6的JAK/STAT信号传导途径。采用ELISA分析证明,在IL-1β和TNFa分别诱导下,依博素可以降低CIA-FLS细胞基质金属蛋白酶MMP-1、MMP-3和化学趋化因子IL-8、RANTES的分泌水平。综上所述,本研究首次在细胞水平证明,依博素对炎症细胞因子IL-1β、IL-6和TNFa的表达水平及信号传导途径均有显著抑制作用,在其作用下上述炎症因子表达水平下降,生物活性降低,因此可以缓解类风湿性关节炎症状,达到治疗的作用。本研究结果为依博素抗炎作用机理提供了充实可靠的实验证据,为治疗类风湿性关节炎新药研究奠定了相关理论基础。