血吸虫病是目前我国危害最严重的寄生虫病之一,湖北钉螺(Oncomelania hupensis)是日本血吸虫(Schistosoma japonicum)唯一的中间宿主,在血吸虫病传播中起着十分重要的作用。实践证明,化学药物灭螺是阻断血吸虫病流行的重要措施之一。目前氯硝柳胺是世界卫生组织(WHO)唯一推荐可应用于现场的灭螺药,为了改变目前杀螺药单一的局面,本研究在氯硝柳胺重新解构、重组形成一种新型化合物——氯代水杨胺的基础上,对不同制剂氯代水杨胺的杀螺效果进行研究并筛选出最佳制剂；将选出的制剂规模化生产后,在实验室及现场分别验证其灭螺效果,同时进行杀螺机理及非靶动物的急性毒性试验研究,还对氯代水杨胺的杀螺成本与效益作了评估,为氯代水杨胺应用于现场提供科学依据。1.氯代水杨胺(LDS)的最佳制剂筛选LDS是由10%的氯代水杨胺原药与90%不同比例的分散剂、悬浮剂、稳定剂、填充剂(活性硅藻土)等填料采用不同的生产工艺(即反应时间、反应温度和反应介质等)加工获得。填料的比例和生产工艺(总称为制剂)的不同,直接影响LDS的成本与灭螺效果。本章通过实验室浸杀和喷洒灭螺实验,试图从B1、B2、B3、B4等4种不同制剂LDS中筛选出最佳灭螺制剂。浸杀灭螺结果显示,四种制剂的钉螺死亡率均具有时-效和量-效关系,即LDS浓度相同时,钉螺死亡率随时间的延长而升高(p<0.05)；LDS作用时间相同时,钉螺死亡率随药物浓度的增加而升高(p<0.05)。当LDS浓度在0.4mg/L以上时,B2制剂在浸杀钉螺48h以上时钉螺死亡率均达100%(p<0.05),灭螺效果与氯硝柳胺乙醇胺盐(WPN)无统计学差别(p>0.05)；浸杀72h钉螺的半数致死浓度(LC5o)小于1mg/L,且B2制剂最低。喷洒灭螺72h,制剂剂量为0.2g/m2时,B1和B2钉螺死亡率均达到95%,B3和B4钉螺死亡率均在95%以下；剂量为0.4g/m2时,B1和B2钉螺死亡率分别为100%、95%,B3和B4钉螺死亡率分别为92%和88%。统计结果表明,B1和B2均达到国家标准要求,与对照无统计学差别(p>0.05),且均优于B3和B4(p<0.05)；半数致死量(LD50)均小于1g/m2,且B2制剂最低。根据中华人民共和国农业行业标准《农药登记用杀钉螺剂药效试验方法和评价》(NY/T 1617-2008),以及上述实验结果综合考虑,选择B2制剂用于下一步扩大生产的定型产品,为下一步在实验室进行重复、系统的药效研究和现场的应用研究打下基础。2.氯代水杨胺实验室灭螺效果研究将LDS的B2制剂送至厂家规模化批量生产后,在实验室进行浸杀、喷洒、撒粉灭螺及浸杀钉螺螺卵重复性实验。结果显示,浸杀、喷洒、撒粉灭螺和浸杀螺卵实验均具有明显的时-效和量-效关系。LDS浸杀灭螺时,浓度为0.2mg/L、浸杀72h,或LDS浓度不低于0.4mg/L、浸杀时间不少于48h,钉螺死亡率均可达100%；喷洒灭螺时,剂量在0.2g/m2或以上,作用72h或更长时间,钉螺死亡率均大于95%；撒粉灭螺时,剂量为0.8g/m2或以上,168h钉螺死亡率均大于95%。浸杀螺卵时,LDS浓度为0.4mg/L或以上,螺卵死亡率均在90%以上。统计结果表明,LDS杀灭钉螺和螺卵的效果与WPN相当(p>0.05),且在浸杀和喷洒灭螺时起效更快速(p<0.05)根据中华人民共和国农业行业标准《农药登记用杀钉螺剂药效试验方法和评价》(NY/T 1617-2008)的规定,浓度(剂量)为0.2mg/L(g/m2)或以上的LDS浸杀或喷洒钉螺72h,钉螺死亡率分别达100%和96%以上,达到国家规定合格产品的行业标准,可作为现场灭螺药物使用。考虑到现场钉螺孳生环境复杂,在现场使用时可适当加大用量。3.氯代水杨胺现场灭螺效果研究在武汉市长江江滩和孝感市府河河滩、湖北省和全国范围内分三个阶段进行了LDS浸杀、喷洒、撒粉现场灭螺效果研究。武汉市现场灭螺结果显示,LDS浓度为0.2mg/L时,浸杀72h钉螺死亡率可达100%,浓度为0.4mg/L或更高时,浸杀48h或更长时间,其死亡率均可达100%,其72h灭螺效果与WPN相似(p>0.05),但48h灭螺效果有差异(p<0.05),LDS组钉螺死亡率较高。喷洒灭螺和撒粉灭螺趋势与浸杀相似。表明,LDS现场灭螺效果与WPN相似,但起效时间更短。湖北省灭螺药效现场扩大验证选择了代表性的山丘型丘陵亚型(京山、钟祥)、湖沼型洲滩亚型(孝感市、应城市、洪湖市)、湖沼型湖汉亚型(阳新县)、湖沼型垸内亚型(潜江市、公安县、嘉鱼县、监利县)等有螺地理环境。结果显示,在4类地理环境现场,LDS各组灭螺时间较长时其效果与WPN相似(p>0.05)；浸杀灭螺0.2 mg/L,72h钉螺死亡率均超过95%；喷洒灭螺0.4g/m2,168h钉螺死亡率均大于85%；撒粉灭螺0.6g/m2或以上168h,4类地区钉螺的死亡率均大于85%。4种地理类型灭螺效果统计分析显示,采用浸杀法灭螺各地区间无统计学差异,杀螺效果稳定；采用喷洒和撒粉法,湖沼型垸内亚型地区灭螺效果略低于其他类型地区。全国范围内现场扩大试验选择安徽、湖南、江苏(湖沼型),四川、云南(山丘型)5省。结果显示,0.2mg/L浓度的LDS浸杀灭螺72h,除安徽省外,钉螺死亡率均可达96%以上,其中湖南省最高(100%)；0.4g/m2剂量的LDS喷洒灭螺72h后,钉螺死亡率大部分省(湖南、安徽和四川)均能达到85%以上,其中湖南省钉螺死亡率最高,与其他4省存在明显差异(p<0.05)；0.6g/m2的LDS喷洒灭螺168h,5省均达86%以上；0.6g/m2剂量的LDS撒粉灭螺72h,各省(安徽、江苏、四川、云南)钉螺死亡率均达到85%以上,4省差异无统计学意义(p>0.05)。各省LDS灭螺效果与WPN均无显著差异(p>0.05),表明,LDS的杀螺效果与WPN无异、重复性好,可用0.4mg/L、0.6g/m2的LDS推广至全国现场进行浸杀、喷洒(撒粉)灭螺。根据5省地理类型分类统计灭螺效果差异,结果显示,现场喷洒试验,湖沼型3省间LDS组喷洒钉螺死亡率在各时间段均有差异(p<0.05),其他灭螺方法各省之间无差异(p>0.05)。表明,在同一地理类型,LDS浸杀和撒粉杀螺效果较稳定,喷洒杀螺效果在山丘型地区较湖沼型地区稳定,故在湖沼型地区现场灭螺,选择浸杀和撒粉法效果较好。4.氯代水杨胺急性毒性实验研究LDS进行非靶生物(鹌鹑、蜜蜂、家蚕、斑马鱼)急性毒性实验和大鼠经口、经皮、经鼻吸入实验,家兔眼睛刺激性、皮肤刺激性和致敏实验。根据中华人民共和国国家环境保护总局《化学农药环境安全评价试验准则》和中华人民共和国国家标准《农药登记毒理学试验方法》(GB15670-1995)的界定,LDS对鹌鹑为无毒,对蜜蜂、家蚕为低毒,对斑马鱼为中毒。对哺乳动物大鼠经口、经皮、经鼻吸入均属于微毒级；对家兔眼、皮肤无急性刺激性；对豚鼠属弱致敏类。与WPN比较,LDS经口毒性降低(p<0.05),对哺乳动物安全性提高,适合于现场应用；其鱼毒性也降低(p<0.05),在杀螺有效浓度范围内对鱼类安全。5.氯代水杨胺杀螺的超微结构观察钉螺的组织化学研究显示,LDS主要通过作用于钉螺的肝脏,导致钉螺死亡。本章在超微结构水平观察LDS对钉螺肝脏的作用,结果显示,钉螺经LDS水溶液浸杀后肝细胞发生了明显变化,肝细胞水肿、细胞核肿胀、异染色质增多,严重时核膜破损甚至溶解；粗面内质网扩大呈空泡状或呈同心圆性板层小体；线粒体变性、嵴断裂以至消失,基质电子密度降低,呈空泡变。钉螺肝细胞内分泌颗粒增多。WPN组呈现相似的结构变化,而对照组未见线粒体、内质网及其他结构的变化。因而推测,钉螺体内代谢障碍、能量合成和释放过程受阻,钉螺最终因蛋白质、脂类合成障碍以及缺乏能量供应而死亡。6.氯代水杨胺成本效益评估本章从药物成本、人力资源成本、单位灭螺成本和单位成本灭螺面积等方面,系统比较和评估了LDS与WPN、荣宝的现场灭螺成本效益。结果显示,喷洒灭螺面积(10000 m2)相同时,LDS的商品价格(600元)较荣宝(1200元)降低了50%,较WPN(730元)降低了18%；现场施药的人力资源费用,根据现场实际工作时间统计,LDS与WPN相同(60元),均较荣宝低(90元)。单位灭螺成本统计显示,LDS的灭螺成本单价为0.066元/m2、WPN为0.079元/m2、荣宝为0.129元/m2。在相同费用(1万元)购买灭螺药条件下,可灭螺面积分别为LDS为15.152hm2、WPN为12.658 hm2、荣宝为7.752 hm2,单位成本灭螺面积,LDS较WPN增加约20%,较荣宝增加约95%。综上所述,从社会效益和经济效益分析,LDS具有杀螺起效时间短、效果好、稳定性强、对水生动物和哺乳动物毒性较低或无毒、灭螺费用低等优点,可应用于灭螺现场使用,以改变目前杀螺药单一的局面,为我国血吸虫病的控制作出贡献。