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本文研究了芽孢杆菌碱性果胶酶菌种的筛选与鉴定、酶发酵条件的优化、酶的分离纯化与性质以及酶在绿色食品和有机食品中的应用,主要研究内容和结论如下:
从碱性土壤中筛选出碱性果胶酶产率较高的菌株S-2和S-4,它们在形态特征、培养特征以及生理生化特征方面存在较大差异。经分子生物学方法和经典方法鉴定表明,菌株S-2属B.gibsonii,菌株S-4属B.clausii。
分别优化了B.gibsoniiS-2和B.clausiiS-4碱性果胶酶高产固态发酵条件。B.gibsoniiS-2的最佳培养基组成为:甜菜渣5.0g,酵母膏0.15g,Na2CO30.09g,KH2PO430mg,MgSO4·7H2O27mg,水15mL;种龄为24h,接种量2mL,培养温度35℃,发酵时间48h,酶产率达到3700u/g。B.clausiiS-4的最佳培养基组成为:甜菜粕5.0g、麸皮2.0g、KH2PO40.015g、MgSO4·7H2O0.25g、Na2CO30.12g、水20mL,40℃发酵72h,酶产率达到2300u/g。
30倍(v/w)NaeCO3/NaHCO3缓冲液30℃浸提1h,B.gibsoniiS-2碱性果胶酶提取收率最高。对B.gibsoniiS-2和B.clausiiS-4粗酶液的性质研究表明:它们的最适pH均为10.5,最适温度均为60℃;前者在pH9.0-pH10.5或35℃时较稳定;后者在pH9.5-pH11.0或40℃时较稳定;Ca2+、Mg2+对它们均有明显激活作用,Mn2+、Cu2+、Fe2+、Zn2+对它们均有强烈抑制作用;不过Tween80和SDS对后者也有明显激活作用。
对B.gibsoniiS-2粗酶液的酶谱进行了系统分析。B.gibsoniiS-2粗酶液经超率、硫酸铵沉淀、FastFlowExpress-ionD、SPSepharoseFastFlow得到了三个均一组分(S-Ⅰ、S-Ⅱ和S-Ⅲ),都具有碱性聚半乳糖醛酸酶活性;它们的相对分子质量和等电点分别为39kDa和5.4,37kDa和7.4,38kDa和8.2;最适温度和Km分别为60℃和1.2mg/ml、55℃和0.9mg/ml、60℃和1.1mg/ml;最适pH均为pH10.5;Mn2+、Zn2+对它们都有抑制作用,Tween80、Tween20、Mg2+对它们都有激活作用;它们分别对聚半乳糖醛酸钠的反应速度大于果胶,同时分别对果胶的反应速度又大于酯化果胶。
B.gibsoniiS-2和B.clausiiS-4碱性果胶酶对黄瓜黄化苗具有诱导抗病效果,具有用于绿色食品和有机食品的潜在前景。B.gibsoniiS-2碱性果胶酶粗酶液(200u/ml)在pH8.0时抗病效果较好;B.clausiiS-4碱性果胶酶粗酶液(20u/ml)在pH8.0时抗病效果较好。黄瓜黄化苗经B.clausiiS-4碱性果胶酶诱导后,其过氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)和过氧化氢酶(CAT)活性上升,可溶性蛋白和维生素C含量升高,而丙二醛(MDA)和游离脯氨酸含量下降,活性氧产生速率受到抑制。可见,碱性果胶酶诱导黄瓜抗病作用是通过诱导植物体内多种防御相关物质来实现的。