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稻瘟病是由子囊菌Magnaporthe oryzae(Hebert) Barr(无性世代为Pyricularia oryzae (Cooke)Sacc.)引起的广泛发生在世界各稻区的最主要的病害之一。近年来其危害面积逐年扩大,危害程度日趋严重,已成为水稻高产稳产的主要障碍因素之一。传统的抗病育种主要依赖于抗性鉴定和植株表型选择,要求具有丰富的经验和长达数年甚至十几年的时间。由于受稻瘟病发病条件的限制,以及缺乏对抗病基因有效的追踪方法,常规育种中很难选育出同时具有多个抗病基因的持久抗病品种。另一方面,抗病基因是植物-病原菌相互作用的一个关键因子,克隆抗病基因是研究植物抗病机制,揭示植物-病原菌相互作用机理的基础。因此,对稻瘟病抗性基因进行精细定位,寻找与之紧密连锁的分子标记和克隆稻瘟病抗性基因具有重要的意义。云引是引自云南省农业科学院的常规粳稻品种,应用多菌株混合田间注射接菌、室内喷雾接菌和单一菌株离体鉴定的技术对粳稻云引进行稻瘟病抗性鉴定,结果表明云引能够抗所接的60个稻瘟病菌株中的58个菌株,说明云引具有较为广谱的稻瘟病抗性。为更好地利用云引的稻瘟病抗性基因,本研究致力于对云引的稻瘟病抗性基因Pi-y43(t)进行精细定位和图位克隆,得到了如下结果:⑴Pi-y43(t)基因的精细定位在将云引稻瘟病抗性基因精细定位在3.2cM范围内的基础上,进一步在目标区域内寻找公共的SSR标记并结合新开发的5对新SSR标记,构建了目标区域的电子物理图,对稻瘟病抗性基因Pi-y43(t)进行了精细定位,最终将Pi-y43(t)定位于标记FJK42与RM14184之间0.64cM的区域内,构建了Pi-y43(t)基因区域的精细遗传图,获得了3个与目标基因共分离的分子标记,分别为RM6307、RM208及Pibdom。⑵目标区域内的基因预测与候选基因的确定利用6种生物信息学软件,分别是ORF Finder、RiceGAAS、Softberry三种软件的预测及Gramene、RAPDB及RGAP三个数据库的注释分析对稻瘟病抗性基因Pi-y43(t)所在的区域进行基因预测,搜索具有抗病基因保守结构的候选基因,对候选基因进行了RT-PCR分析,确定了Piy43-3为唯一候选基因,测序结果表明与已克隆的稻瘟病抗性基因Pib同源性为99%。⑶候选基因Piy43-3的克隆及序列分析以PibCDS(AB013449.2)设计引物扩增云引的cDNA,测序结果表明云引品种中含有完整的Pib基因的开放阅读框;采取分段克隆测序策略,以Pib (AB013448)基因序列设计引物,扩增云引基因组DNA,经测序拼接后搜索表明云引中含有完整的稻瘟病抗性基因Pib。⑷云引Pi-y43(t)基因与Pib基因的区别与联系通过苗期喷雾接种及成株期人工注射接种,鉴定云引与Pib单基因系对稻瘟病菌株“四川-43”的抗、感反应,云引高抗“四川-43”菌株,而含Pib基因的单基因鉴别系对“四川-43”表现为中抗,表明云引的Pi-y43(t)与Pib基因对稻瘟病菌株“四川43”抗性的差异。⑸云引Pib同源基因Pib2的克隆及序列分析以Pib2(AB013450)基因序列设计引物扩增云引及Pib单基因系基因组DNA,经测序拼接后进行BLAST分析,结果表明云引的Pib2基因存在多个位点的碱基变异。用FGENESH软件对云引的Pib2与NCBI登录的Pib2进行结构预测比较,发现云引的Pib2由4个外显子和3个内含子组成,氨基酸水平上与NCBI登陆的氨基酸序列比较,发生了大片段的缺失与变异。