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花生(ArachishypogaeaL.)是我国重要的油料作物和经济作物之一。但由于花生栽培种的遗传基础狭窄与贫乏,严重影响了其产量和品质。而花生属野生种种质资源丰富,基因具有多样性,且大部分具有栽培种所没有的优良品质。但在常规条件下,花生栽培种与多数野生种杂交不亲和,影响这些野生种的有效利用。体细胞杂交法能克服杂交不亲和性,使野生种的利用成为可能。体细胞杂交法能否成功应用依赖于高频植株再生体系的建立。本论文首先以花生胚小叶为外植体,建立了高频率植株再生体系;以此体系为培养基础初步建立了花生的胚性悬浮系,并对花生原生质体分离、融合及培养条件进行了研究,结果如下:
1.以不同类型19个花生品种成熟种子的胚小叶为外植体,进行丛生芽诱导及植株再生研究。将外植体培养在添加1mg/LNAA和6mg/LBAP的诱导培养基上诱导丛生芽。结果表明,所有的基因型在诱导培养基上均能高频率地形成丛生芽,且在花生栽培种的五大类型中,类型内品种间的丛生芽诱导率和类型间品种平均丛生芽诱导率均存在显著差异(多粒型内品种间无显著差异)。
将丛生芽外植体转移到添加4mg/LBAP的培养基上,促使芽伸长进一步再生植株,结果表明不同基因型品种和类型间品种的植株再生率均存在显著差异。其中珍珠豆型植株的平均再生率最高;普通型次之;多粒型品种的平均植株再生率最低。
2.以不同类型19个花生品种成熟种子的胚小叶为外植体,对体胚诱导及植株再生进行了研究。体胚诱导培养基中添加10mg/L2,4-D。培养4w后统计结果表明,所有花生品种均能高频形成体胚,但五大类型内品种间和不同类型间体胚诱导率差异显著,龙生型品种的平均体胚诱导率最高(80.39%),中间型次之(77.16%),这2个类型的平均体胚诱导率均显著高于多粒型,而与珍珠豆型和普通型无显著性差异。
将形成体胚的外植体转移到添加4mg/LBAP的培养基上,促使体胚萌发再生植株。结果表明不同花生品种的体胚萌发再生植株的频率存在差异。花生五大类型间平均植株再生率,普通型、珍珠豆型、中间型品种平均植株再生率均高于90%,显著高于多粒型和龙生型,龙生型品种平均植株再生率也高于多粒型。,
3.建立了胚性悬浮细胞系:将鲁花14号和近缘野生种A.stenosperma的幼叶诱导的胚性愈伤组织悬浮于添加2mg/L2,4-D,0.4mg/LTDZ,5g/LPVP,1g/L柠檬酸,3%的蔗糖的MSB5液体培养基中,悬浮培养4w后可以形成胚性悬浮细胞系。
4.对花生原生质体的分离、融合及培养进行了研究:在对原生质体进行培养时,培养基中添加0.1%MES和2%椰乳可有效促使原生质体分裂。将Krapts和野生种A.stenosperma的幼叶解离的原生质体用PEG方法进行融合,液体浅层培养于MSB5+3mg/LPic+5g/LPVP+0.1%MES+2%椰乳的培养基中,形成了5mm左右的小愈伤。