目的:SHIP(SH2 domain containing inositol 5′-phosphatase)属于肌醇5′磷酸酶家族,人类SHIP基因位于染色体2q36-37.1。广泛表达于造血细胞。SHIP特异地清除PIP3,包括PI(3,4,5)P3和PI(1,3,4,5)P4,均为PI3K的产物,而后两者为细胞内的第二信使,在细胞的生存过程中发挥着重要功能,PI3K接受生长信号而被激活,继而产生PIP3,作为第二信使激活下游信号分子蛋白激酶B(AKT/PKB),从而维持细胞的生存而对抗由各种因素引起的细胞凋亡。SHIP基因在造血细胞发生发展及其功能方面起着关键的负调控作用。国外的研究局限在基础领域。如Liu Q等为了调查SHIP在体内的功能,建立了一个SHIP基因敲除的转基因小鼠,此小鼠表现出骨髓细胞的高度增生,从而造成肝脾肿大以及其它重要脏器骨髓细胞的高度浸润。在慢性粒细胞白血病(CML), SHIP基因表达水平明显减少或缺如,原因可能是由于bcr/abl融合基因直接抑制了SHIP基因表达。国内罗建民等对9例急性淋巴细胞白血病(ALL)和32例急性髓细胞性白血病(AML)标本进行了SHIP基因突变检测,并检测了50例健康人标本作为对照。发现22%AML患者和12%ALL患者存在SHIP基因突变,而在健康人标本未发现这些改变,因此,这些改变在白血病患者属遗传学改变。在这些突变中,78%的突变集中在SHIP基因的重要结构域。目前SHIP基因在各亚型白血病细胞中的表达状况及白血病细胞株中的表达谱尚不清楚;白血病细胞内SHIP基因表达对AKT/PKB磷酸化水平的影响亦无报道;在CML中bcr/abl融合基因对SHIP基因的抑制作用有待证实;白血病细胞内SHIP基因促凋亡信号途径也有待进一步研究。因此本课题的主要研究内容如下:第一,采用PCR的方法检测各种类型白血病细胞株及60例白血病临床标本中SHIP基因的表达状况,初步建立SHIP基因在白血病中的表达谱并探讨SHIP基因在白血病中表达的临床意义;第二,检测伊马替尼干预前后K562细胞内SHIP基因表达水平的变化,初步证实bcr/abl融合基因对SHIP基因的抑制作用;第三,采用流式细胞术检测AKT/PKB磷酸化水平与SHIP基因表达的关系及伊马替尼干预前后K562细胞内AKT/PKB磷酸化水平的变化;第四,采用RT-PCR方法检测SHIP基因对BCL-2、Caspase-1、Caspase-3、Caspase-9基因表达的影响;采用MTT法检测SHIP基因对细胞增殖的影响;采用膜联蛋白Ⅴ试剂盒检测SHIP基因对白血病细胞早期凋亡的影响。方法1悬浮细胞培养及伊马替尼配制共培养7株白血病细胞,分别为T细胞系Jurkat细胞、B细胞系Nalm-6细胞、髓细胞系K562、U937、KG-1、HL-60、NB4细胞。采用含10%新生牛血清的RPMI1640,并加入青霉素(100U/ml)和链霉素(100μg/ml)的培养体系培养。培养环境为37℃,5%CO2及饱和湿度。取对数生长期的细胞进行实验。应用高压消毒的三蒸水配制甲磺酸伊马替尼(MI),分装入消毒的EP管4℃保存。取对数生长期的K562细胞进行干预,干预浓度分别为0.5μmol/L、1.0μmol/L、5.0μmol/L、10.0μmol/L。观察时段分别为加药后3h、6h、12h、18h。2实时定量PCR检测SHIP基因表达Trizol一步法提取细胞总RNA,紫外分光光度计定量。逆转录体系为:5×逆转录缓冲液4.0μl,上游引物0.4μg,下游引物0.4μg,dNTPs 0.2μg,逆转录酶1.0μg,DEPC水9.0μl,RNA1.0μg。总体积20.0μl。反应条件为:37℃1 h,95℃3min。阳性模板和检测样品的PCR反应体系为:5×定量PCR缓冲液10.0μl,上游引物1.0μg,下游引物1.0μg,dNTP 0.5μg,荧光探针1.0μl,Tag酶1.5μg,cDNA模板5.0μl,ddH2O30.0μl。总体积50.0μl。反应条件为:93℃2min,93℃45s,55℃45s,共40个循环。3流式细胞术检测蛋白激酶B磷酸化(P-Akt)收集细胞并在含2%甲醛的1×PBS中固定10min,于90%甲醇中4℃孵育30min透膜,计数细胞,每试管内5×105cells,加10μl P-Akt抗体,室温避光孵育45min。上机检测并应用Cell Quest软件进行分析。4半定量逆转录PCR检测凋亡相关基因Trizol一步法提取细胞总RNA,紫外分光光度计定量。逆转录反应体系为:随机六聚核苷酸引物0.5μg,M-MLV 200U,5×逆转录buffer 4μl,dNTPs 2μl,Rnasin 25u,RNA 2μg,用DEPC水补至20μl。37℃6 0min,94℃5 min,1℃2min。PCR反应体系为:10×buffer 5μl,Mgcl2 3μl,dNTP 5μl, 5′引物3μl,3′引物3μl,Tag酶2U,cDNA 2μl,双蒸水补至50μl。94℃5 min,94℃4 5s,Bcl-2、Caspase-1、Caspase-3、Caspase-9、GAPDH退火温度分别为60℃、60℃、68℃、68℃、60℃,45s,72℃1 min,30个循环,72℃再延伸10 min。5 AnnexinⅤ/PI标记染色测定凋亡细胞调整待测细胞浓度为1×106个/ml,取1ml细胞,400g,4℃离心10 min,弃上清,加入1ml冷PBS,轻轻震荡使细胞悬浮,400g,4℃离心10 min,弃上清,重复2次,将细胞重悬200μl Binding Buffer,加入10μl AnnexinⅤ-FITC和5μl PI,轻轻混匀,避光室温反应15 min,加入300μl Binding Buffer,1h内上机检测。6 MTT法测定K562细胞生长抑制率取对数生长期的K562细胞调整密度为5×104/ml,接种于96孔无菌培养板中,每孔200μl。每个时段每个浓度下设3个复孔,实验重复3次。以不加MI的K562细胞做对照组。培养3、6、12、18h后加10μl MTT(10mg/ml),继续培养4h后离心弃上清,每孔加入200μl DMSO终止反应,应用全自动酶标仪测570nm处吸光度(A)值。计算抑制率。7细胞形态观察将各组细胞悬液离心涂片,用瑞特-姬姆萨染色,光镜下观察细胞形态变化。凋亡细胞的特征为核固缩、核边聚、核碎裂、胞膜出泡,并可见典型的凋亡小体等。结果1白血病细胞中SHIP基因表达水平1.1白血病细胞株中SHIP基因表达水平所测结果用拷贝数/μg RNA为单位表示,取三次实验的平均值为最终结果。其中Jurkat细胞为(6.85±0.25)×106/μg RNA,Nalm-6细胞为(6.12±0.47)×103/μg RNA,U937细胞为(3.02±0.23)×105/μg RNA,KG-1细胞为(2.90±0.39)×105/μg RNA,HL-60细胞为(8.15±0.69)×103/μg RNA,NB4细胞为(8.77±0.67)×104/μg RNA,K562细胞为(3.64±0.79)×102/μg RNA。KG-1和U937细胞的表达水平无统计学差异,其余各种细胞间的表达水平均有显著差异(ρ=0.0000)。Jurkat细胞表达水平最高,K562细胞表达水平最低。1.2白血病患者细胞中SHIP基因表达水平及临床意义在36例初治急性白血病(AL)患者中SHIP表达水平为(6.86±3.44)×103,正常对照组为(4.31±2.92)×104,二者差别有统计学意义(ρ=0.0005)。12例复发AL患者SHIP表达水平为(1.05±0.53)×104,与正常对照相比差别亦有统计学意义(ρ=0.0011)。12例慢性粒细胞白血病(CML)患者SHIP表达水平最低,为(6.16±7.65)×102,与正常对照组、初治组及复发组相比,其差别均有统计学意义(ρ=0.0000)。36例初治患者经联合化疗达完全缓解(CR)32例(CR率88.89%),其中SHIP表达水平低于平均水平者16例,达CR14例(CR率87.50%);高于平均水平者20例,达CR18例(CR率90.00%)。两组CR率相比无统计学差异(ρ>0.05)。2伊马替尼对K562细胞内SHIP基因表达的影响实验室常规检测K562细胞的bcr/abl融合基因呈阳性表达。甲磺酸伊马替尼(MI)干预浓度分别为0.5μmol/L、1.0μmol/L、5.0μmol/L、10.0μmol/L。各浓度分别于干预前(0h)、干预后3h、6h、12h、18h 5个时段采集细胞进行检测SHIP基因表达水平,结果显示干预后SHIP基因表达水平显著升高,其中以1.0μmol/L干预18h后SHIP基因表达水平最高(为干预前的34倍)。3伊马替尼对K562细胞内SHIP基因表达及蛋白激酶B磷酸化(P-Akt)水平的影响3.1各系白血病细胞中P-Akt的表达水平所测结果用平均荧光强度表示,取三次实验的平均值为最终结果。其中Jurkat细胞为(48.76±4.01),Nalm-6细胞为(102.41±7.52),U937细胞为(170.19±14.04),KG-1细胞为(119.23±17.71),HL-60细胞为(237.12±28.97),NB4细胞为(94.52±10.76),K562细胞为(97.38±12.72)。以Jurkat细胞表达最低,HL-60细胞表达最高,有统计学差异(ρ=0.0016)。P-Akt的表达水平与SHIP基因表达水平无相关关系(r=-0.5399)。3.2伊马替尼干预K562细胞后P-Akt表达水平的变化干预方法如前述。干预后P-Akt的平均荧光强度随时间延长逐渐降低,以1.0μmol/L干预效果最好,干预前为92.42,干预18h后降为34.16。3.3伊马替尼干预K562细胞后SHIP基因和P-Akt表达的相关性0.5μmol/L、1.0μmol/L和5.0μmol/L的浓度干预后SHIP基因表达随时间延长逐渐升高,至18h达最高峰。同时P-Akt的平均荧光强度逐渐降低,至18h达最低值。二者表达呈显著相关性(r值分别为-0.8527、-0.9275、-0.9656)。10.0μmol/L的浓度干预后SHIP基因在6h达最高峰,12h和18h时又降低。而P-Akt呈持续降低趋势。二者表达无相关性(r=-0.0430)。4伊马替尼对K562细胞内SHIP基因表达及增殖和凋亡的影响4.1 MI干预K562细胞前后Bcl-2、Caspase-1、Caspase-3、Caspase-9基因表达水平的变化结果以待测基因与内对照GAPDH的光密度比值表示。MI干预前后各个时段Bcl-2、Caspase-1、Caspase-3的表达水平无显著变化,各浓度间Bcl-2、Caspase-1、Caspase-3的表达水平亦无显著变化。Caspase-9的表达水平随干预时间延长有升高趋势,特别是1.0μmol/L干预浓度时升高趋势明显;各浓度间在3h、6h表达水平无显著差异,在12h、18h表达水平有显著差异(1.0μmol/L组分别为10.0μmol/L组的1.51和2.04倍),以1.0μmol/L干预浓度时表达水平最高。4.2 SHIP与Caspase-9基因表达的相关性MI 0.5μmol/L、1.0μmol/L、5.0μmol/L干预后SHIP基因表达水平随时间延长而升高,10.0μmol/L干预后6h达最高水平,12h和18h时反而下降;Caspase-9与SHIP基因表达呈直线相关性,以0.5μmol/L组相关性最好(r=0.8582),1.0μmol/L干预18h后达最高表达水平,1.0μmol/L、5.0μmol/L和10.0μmol/L组的相关系数(r值)分别为0.6050、0.6547和0.6030。4.3伊马替尼干预后各组细胞的凋亡率MI干预K562细胞后早期凋亡(AnnexinⅤ+)细胞随时间延长逐渐增多,各干预浓度组间K562细胞的早期凋亡率无统计学差异。4.4伊马替尼干预后各组细胞的生长抑制率MI干预K562细胞后随凋亡细胞的增加生长抑制率升高,细胞活力下降,呈时间依赖性,与浓度无关。4.5伊马替尼干预后细胞形态的变化经瑞特-姬姆萨染色后油镜下观察,细胞形态出现核固缩、核边聚、核碎裂、胞膜出泡,并可见典型的凋亡小体等。结论1 SHIP基因在各种白血病细胞株(T、B及髓系)中均有表达,但其表达水平不一。K562细胞中表达水平最低。在不同组别的白血病患者骨髓细胞中SHIP基因的表达水平亦有差别,其中初治组和复发组的表达水平均低于正常对照组,表明SHIP基因表达在白血病患者中明显受抑。慢性粒细胞白血病患者的表达水平最低,其中bcr/abl融合基因对SHIP基因的抑制作用可能是其原因之一。2甲磺酸伊马替尼干预K562细胞后可使SHIP基因的表达水平显著升高,表明解除或减弱bcr/abl融合基因的抑制作用,可上调SHIP表达。3甲磺酸伊马替尼干预K562细胞后可发现随着SHIP基因表达水平的升高,P-Akt表达水平降低。二者呈明显的直线相关关系。表明SHIP基因通过抑制Akt的磷酸化而发挥对造血细胞的负调控作用。值得进一步实验证实。4甲磺酸伊马替尼干预前后Bcl-2、Caspase-1、Caspase-3的表达水平无显著变化,Caspase-9的表达水平随干预时间延长有升高趋势。SHIP与Caspase-9基因表达呈直线相关,表明Caspase-9在甲磺酸伊马替尼促凋亡过程中表达上调,Caspase-9是否作为甲磺酸伊马替尼促凋亡的起始基因并受SHIP基因控制需进一步实验证实。5甲磺酸伊马替尼干预K562细胞后其凋亡率升高,增殖率下降。呈时间依赖性,与浓度无关。并经形态学的变化证实。表明低浓度MI即可发挥促凋亡作用。