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背景与目的:心源性猝死(Sudden Cardiac Death,SCD)绝大部分是由恶性心律失常所诱发的,但由于其恶性心律失常发病的机制仍不是非常清楚,临床上暂时无有效的预防和治疗SCD的方法。大量研究证实,h ERG钾通道离子电流在动作电位的3期复极化中起着重要的作用,且已证实LQT2的发生是由h ERG基因通道功能的改变引起的。在我国,以II型LQT2致命性心律失常多见。已有研究证实,micro RNAs(mi RNAs)参与了h ERG途径的功能调节。本研究组前期已通过双荧光素酶报告基因法、实时定量PCR、Western Blotting、激光共聚焦筛选出mi R-103a-1与h ERG基因具有相关性。本实验旨在在电生理水平进一步验证mi R-103a-1与h ERG的相关性,探讨mi R-103a-1作为新的工具来评估LQTS发生机制的可行性,并为研发新的高特异性抗心律失常药提供新思路。材料与方法:常规培养的人胚肾细胞(HEK293T)是进行膜片钳实验理想的细胞系。瞬时转染h ERG后进再一步转染cel-mi R-67、mi R-103a-1或mi R-103a-1加AMO-103a-1。p RK5-GFP用于监测转染效率。cel-mi R-67作为随机阴性对照。应用全细胞膜片钳技术检测mi R-103a-1对h ERG蛋白通道的Ikr电生理特性的影响,HEK293T细胞收获在24小时(仅h ERG质粒),48小时(h ERG后再转染mi R-103a-1或cel-mi R-67)或72小时(h ERG的质粒随后的mi R-103a-1和AMO-103a-1)转染后相对应。结果:1.mi R-103a-1对h ERG通道Ikr电流幅度的影响:mi R-103a-1干扰h ERG前后Ikr激活电流幅度分别为660.67±159.55 p A和253.72±47.35 p A,干扰后比干扰前显著降低了61.60%(n=6,p<0.05);尾电流的电流幅度分别为981.28±5.94 p A和376.23±2.84 p A,干扰后比干扰前降低了61.66%(n=6,p<0.05)。而阴性对照cel-mi R-67未能影响Ikr激活电流(干扰前:660.67±159.55p A,干扰后:691.30±143.57 p A,4.6%,n=6,P>0.05)和尾电流(cel-mi R-67干扰前:981.28±5.94p A,干扰后:985.79±3.96 p A,0.45%,n=6,P>0.05)的幅度。正如预期的,AMO-103a-1可以沉默mi R-103a-1的影响。共转染mi R-103a-1和AMO-103a-1的细胞激活电流幅度从253.72±47.35 p A(n=6)(仅转染h ERG和mi R-103a-1)恢复到595.75±99.08 p A(n=6)(p<0.05),同样尾电流的幅度也从376.23±2.84 p A恢复到984.58±6.49 p A(n=6)(p<0.05)。与仅转染h ERG的细胞相比,共转染mi R-103a-1和AMO-103a-1显示出在激活电流(595.75±99.08 p A vs 660.67±159.55 p A,p>0.05)和尾电流(984.58±6.49 p A vs 981.28±5.94 p A,p>0.05)方面仅有微小的差异。2.mi R-103a-1对h ERG通道Ikr电流的特性的影响。(1)mi R-103a-1干扰h ERG钾通道前后Ikr电流的斜率因子从9.99±0.34 m V减少为6.88±0.44 m V(n=6,P<0.05),而半激活最大电压分别为-8.66±0.38 m V和-25.31±0.52m V(n=6,p<0.05)。与野生型h ERG通道相比,mi R-103a-1干扰h ERG后使得通道明显向复极化方向偏移,斜率变小。有趣的是,cel-mi R-67干扰h ERG前后V1/2分别为-8.66±0.38 m V和-20.07±3.30 m V(n=6,p<0.05),而斜率因子K没有变化(9.99±0.34 m V VS 9.49±0.27m V,n=6,p>0.05)。转染mi R-103a-1加AMO-103a-1干扰h ERG前后V1/2分别为-8.66±0.38 m V和-18.64±0.45 m V(n=6,p<0.05),K分别为9.99±0.34 m V和8.29±0.39 m V(n=6,p>0.05)。转染mi R-103a-1加AMO-103a-1与只转染mi R-103a-1干扰h ERG前后V1/2和K没有统计学差异(p>0.05)。(2)稳态失活电流中,mi R-103a-1干扰h ERG前后V1/2和K没有明显变化(干扰前V1/2=-39.07±3.13 m V,K=14.96±2.88 m V;干扰后V1/2=-46.88±4.35m V,K=11.30±3.90m V;n=6,p>0.05)。同样cel-mi R-67干扰h ERG前后V1/2和K也没有统计学差异。转染mi R-103a-1加上AMO-103a-1干扰h ERG前后V1/2和K同样也没有明显变化。转染mi R-103a-1加AMO-103a-1与只转染mi R-103a-1干扰h ERG前后V1/2和K没有统计学差异。(3)mi R-103a-1干扰h ERG后Ikr电流的失活速度更快(n=6,P>0.05),另外,AMO-103a-1几乎消除了mi R-103a-1的影响,而阴性对照cel-mi R-67没有影响h ERG通道蛋白的失活时间常数。(4)mi R-103a-1或cel-mi R-67干扰h ERG前后Ikr电流失活后恢复时间常数没有差异(n=6,P>0.05),并且对IKr去失活恢复时间常数的快、慢成分也无显著性差异(n=6,P>0.05)。结论:我们的研究结果表明h ERG基因是mi R-103a-1的靶基因。AMO-103a-1可以沉默mi R-103a-1的影响。我们的研究结果为更好的了解h ERG蛋白通道的作用机制提供了新的见解,并为进一步基因治疗LQTS打下了基础。然而,这些结果需要在动物模型中、临床前研究和临床研究中一步验证。