前言肿瘤转移是癌症患者死亡的重要原因，癌细胞主要通过血道和淋巴道播散。大肠癌是危害人类健康的常见恶性肿瘤，早期局部淋巴结转移十分常见，但其分子机制尚不十分清楚。近年已发现血管内皮生长因子（VEGF-C和-D）激活其受体VEGFR3信号通路可诱导肿瘤淋巴管生成，从而影响肿瘤的转移。但也存在某些令人困惑的现象。比如，虽有些癌组织中可检测到VEGF-C表达，却并未观察到有明显的新生淋巴管形成，提示除VEGF-C及其受体VEGFR3参与外，还可能受其他负性调控因素的作用。新近发现3型神经轴突导向分子Sema3的两种受体NRP1和NRP2在胚胎脉管发育中具有重要作用，其中NRP2与淋巴管发生密切相关。已发现在基因敲除NRP2的突变小鼠，其淋巴系统出现小淋巴管和毛细淋巴管缺乏或数量减少，而血管系统和其他的大集合淋巴管发育正常，提示胚胎淋巴管发育选择性地需要NRP2的参与。研究还发现胚胎早期从静脉出芽形成的原始淋巴囊并不需要NRP2参与，而在其后期从原有淋巴管内皮出芽形成新生淋巴管的过程中NRP2却十分必需，表明NRP2对胚胎的毛细淋巴管成熟具有非常重要的作用。大肠淋巴管内皮细胞丰富地表达NRP2。为此，我们推测大肠淋巴管内皮细胞的NRP2表达在大肠癌淋巴管生成中可能具有重要的作用。但迄今为止，关于大肠癌细胞与高表达NRP2的淋巴管内皮细胞间的相互作用以及NRP2对淋巴管生成的影响却了解甚少。目前研究发现NRPs具有两种功能：在神经导向中，NRPs常与3型Sema和Plexins一起形成复合物，诱导Sema信号转导。其中NRP2只与Sema3F结合并引起对上颈神经节(SCG)轴突的排斥。脉管生成研究发现NRP1作为VEGF家族协同受体，可增强VEGF165与VEGFR2的结合，加强VEGF165诱导的内皮细胞趋化性及有丝分裂原性，诱导血管生成。这样两个不同的配体（Sema和VEGF）结合同一受体（NRPs），却又介导两个不同的过程——神经导向和血管生成，提示这些过程可能具有共同的分子基础。Sema也影响血管，其中Sema4D在体外诱导内皮细胞迁移和小管形成，体内刺激血管生成，而Sema3A则抑制血管形成，推测其可能系与NRP1受体竞争性结合，抑制VEGF165诱导的血管生成有关。新近研究显示Sema3F也可抑制表达功能性NRP2受体的黑色素瘤细胞的浸润与转移，并抑制血管向肿瘤内生长。NRP2主要表达于淋巴管内皮细胞，且在肠道淋巴管广泛表达，然而Sema3F与NRP2结合对大肠癌淋巴管生成的影响及其机制仍不清楚。Sema3F是否与VEGF-C竞争性结合NRP2削弱其促淋巴管生成的效应，还是通过其他机制抑制大肠癌淋巴管生成，尚有待进一步探讨。因此，我们推测高表达Sema3F可能对肿瘤细胞的增殖产生抑制，通过与受体NRP2的结合发挥抑制肿瘤淋巴管生成的作用。本研究中，我们首先调研了人类结直肠腺癌中Sema3F和NRP2的表达状况，探寻两者与淋巴管生成和淋巴道转移相关的肿瘤病理学特征之间的关系。我们通过体外构建Sema3F shRNA干扰载体，将其与Sema3F全长载体分别转染人结直肠癌细胞系，体外重点观测Sema3F的表达对结直肠癌细胞株增殖、迁移、粘附、凋亡等的影响；体内建立Sema3F转染细胞原位移植瘤和转移瘤模型，重点观测Sema3F表达对体内肿瘤生长和转移的作用。另一方面，分离培养人淋巴管内皮细胞，并构建针对NRP2的shRNA干扰载体和表达载体，转染淋巴管内皮细胞后，观察NRP2表达对淋巴管内皮细胞生长、迁移、小管成型等影响。结果1.结直肠癌组织Sema3F及受体#RP2的表达与肿瘤的进展和转移密切相关：①结直肠癌组织部分表达Sema3F。肿瘤组织中Sema3F的mRNA表达显著地低于癌旁粘膜组织（P<0.05）；转移组肿瘤组织与未转移组的肿瘤组织相比，Sema3F蛋白的表达情况却显著降低（P<0.05）。②肿瘤组织中NRP2的mRNA表达显著地高于癌旁粘膜组织（P<0.05）；转移组肿瘤组织NRP2的mRNA表达水平也高于转移组肿瘤对应的癌旁粘膜组织（P<0.05）；未转移组肿瘤NRP2的mRNA表达也显著地高于对应癌旁组织（P<0.05）；转移组肿瘤组织与未转移组的肿瘤组织相比，NRP2显著地增高（P<0.05）。NRP2蛋白在肿瘤组织内的总体表达阳性率为54.2%；且发生淋巴管侵犯和淋巴结转移的病例表达率为100%。在正常粘膜，NRP2几乎检测不到有表达，而肿瘤组织则呈现较强的胞浆表达。肿瘤组织NRP2的表达与肿瘤的转移状态密切相关（P<0.05）。③Sema3F的高表达与肿瘤浸润程度、分化程度等恶性生物学行为特征和淋巴管侵犯、局部淋巴结转移以及Dukes分期等影响肿瘤转移的特征呈现负相关关系（P<0.05）。NRP2的表达则与肿瘤浸润深度、血管侵犯、淋巴管侵犯、局部淋巴结转移和Dukes分期有较为密切的关系（P<0.05）。④肿瘤微淋巴管存在随瘤体部位不同而改变的特点，呈现出分布、形态和数量（微淋巴管密度）的差异。肿瘤内微淋巴管密度（MLD）值与Sema3F表达呈显著的负性相关关系（P<0.05），随着肿瘤Dukes分期的进展，Sema3F的总体表达强度逐渐下降，而MLD值则显著抬升（P<0.05）。2. #RP2表达具有促进淋巴管生成作用：①采用免疫磁珠法成功分离的LEC，形态学上具有典型的内皮细胞“铺路石”状生长特征，表达包括D2-40、LYVE-1、podoplanin和VEGFR3等多种较为特异的淋巴管内皮标记物。不表达vWF、CD31等常见血管内皮标记；②LEC对VEGF-C促增殖具有良好的生物学反应；直接上调LEC中NRP2的表达株pLEC，在未添加10 ng/ml VEGF-C时，增殖能力较LEC即有增长（P<0.05）；而在相同剂量（10 ng/ml）的VEGF-C诱导下，pLEC株则显示出最为活跃的增殖能力（P<0.05）；干扰NRP2后，iLEC株增殖并未受到明显影响，而添加VEGF-C对iLEC增殖虽然有明显的刺激作用（P<0.05），但增殖能力与LEC刺激组也无明显差异（P>0.05）；③当通过表达载体上调NRP2在LEC中的表达后，pLEC株约48 h就开始显示出小管形成能力的增强，其小管形成的速度明显较对照组快。而iLEC株在实验结束时，仍不能形成典型、完整的小管样结构。提示：NRP2表达水平的改变，可以显著影响LEC在体外形成小管样结构的能力；④上调NRP2的pLEC株在各组细胞中具有最强的迁移能力。pLEC株中迁移细胞的数量几乎是cLEC组的149%，重复实验统计证实两者之间存在显著的统计学差异（P<0.05）。当采用shRNA干扰下调NRP2在LEC中的表达后，相应的iLEC细胞株运动能力也受到严重的影响。较之cLEC细胞而言，iLEC细胞的迁移细胞数仅为对照的84%，但两者之间并无统计学差异（P>0.05）；⑤使用200 ng/ml的VEGF-C作为趋化源后，我们发现与EBM-2对照组比较，添加了招引物VEGF-C的实验组均产生数量更多的迁移细胞（P<0.05），说明VEGF-C对原代培养的LEC细胞确实可以产生诱导趋化的效果。进一步在实验组中比较cLEC株，我们发现无论是pLEC株还是iLEC株，细胞迁移的数量与cLEC都有显著地差异（P<0.05）；⑥上调NRP2的表达后，pLEC中整合素G9亚基的mRNA表达水平并无显著变化，而H1亚基的mRNA水平显著上调（P<0.05）；而干扰NRP2表达的iLEC中整合素G9亚基的mRNA表达水平显著上调（P<0.05），而H1亚基的mRNA水平显著下降（P<0.05）。进一步研究整合素蛋白表达水平的变化，发现上调NRP2的表达后，pLEC中整合素G9亚基显著下调（P<0.05），而H1亚基的mRNA水平显著上调（P<0.05）；而干扰NRP2表达的iLEC中整合素G9亚基和H1亚基的水平均显著下调（P<0.05）。整合素水平的变化可能是NRP2调控上述LEC生物学行为的根本机制。3.上调Sema3F的表达呈现出抗肿瘤效应①上调Sema3F的表达可以显著地降低SW480细胞株的增殖能力（P<0.05），而干扰其表达则显著地促进瘤细胞的增殖（P<0.05）。双转NRP2表达载体后，瘤细胞的增殖并未受其显著地影响。②肿瘤细胞内Sema3F过表达后，处于S期的细胞比例显著降低，而干扰Sema3F，S期细胞比例则显著增加。然而各组间的总体凋亡率并没有显著改变；③上调Sema3F表达水平的移植瘤生长速率明显减缓，体积明显缩小；进一步研究发现瘤细胞增殖活性较低。④上调Sema3F的肿瘤细胞（SW480-A）接种60 min后，开始显示出较对照细胞明显降低的粘附能力（P<0.05）。而调控NRP2的表达状态并没有显著改变瘤细胞的基质粘附水平；⑤下调Sema3F表达水平的细胞（SW480-C）较之对照组和上调组细胞显示出运动能力的低下；⑥Sema3F的表达上调了肿瘤内整合素GvH3的水平，而Sema3F的表达在RNA干扰之后，减弱了整合素GvH3上调的程度；4. Sema3F的表达使得移植瘤淋巴管生成及转移受到抑制：①单独上调Sema3F的SW480-A0细胞株，移植瘤内淋巴管密度与对照SW480-Par组比较无明显差异，但同时上调NRP2的SW480-A2株所形成的移植瘤，淋巴管生成的抑制则较为明显（P<0.05）。另一方面，针对Sema3F的shRNA干扰可以显著地增加肿瘤内淋巴管生成的程度（P<0.05）。单纯下调Sema3F的SW480-C0株，瘤内淋巴管密度较SW480-A0组比较无明显差异（P<0.05），而在此基础上同时转染NRP2，则进一步促进了瘤内淋巴管的生成，SW480-C6形成的移植瘤内毛细淋巴管密度显著增加（P<0.01）；②上调Sema3F对肿瘤的转移也能产生抑制，但这种效应需要NRP2的参与。另一方面，干扰Sema3F而上调NRP2后，肿瘤转移几率明显增加。结论⑴人结直肠癌中Sema3F表达水平下调与肿瘤发生进展密切相关，高表达Sema3F将导致瘤细胞增殖、迁移、粘附能力的下降从而抑制肿瘤细胞的生长和播散。⑵NRP2的表达通过增强淋巴管内皮细胞增殖、迁移、趋化和小管形成的能力可显著地促进淋巴管生成。上述结果表明，神经轴突导向分子Sema3F作为的潜在的肿瘤抑制因子，其表达可通过受体NRP2抑制结直肠癌的生长和转移。可能具有潜在的治疗研究价值。