研究背景支气管哮喘是由多种细胞(如嗜酸粒细胞、肥大细胞、T淋巴细胞、中性粒细胞、气道上皮细胞等)和细胞组分参与的气道慢性炎症性疾病。其中嗜酸粒细胞(eosinophil，Eos)是哮喘气道炎症反应的主要效应细胞。Eos来源于骨髓CD34~+祖细胞，传统的观点认为，个体发育成熟后造血干细胞的分化和成熟仅局限于骨髓。但近年的研究发现，造血干细胞在特定细胞因子和趋化因子协同作用下也可以由骨髓释放出来，定位到各种组织和器官，在局部生长因子的调控下，分化和成熟为特定的成熟细胞。对哮喘患者和哮喘小鼠模型的研究发现，抗原激发后骨髓CD34~+祖细胞增殖、分化为成熟Eos增多，同时外周血及支气管肺泡盥洗液(bronchial alveolar lavage fluid，BALF)中CD34~+祖细胞也明显增加，说明哮喘状态下骨髓CD34~+祖细胞本身可以迁移至外周血和支气管黏膜，成为局部Eos的重要来源之一。目前的研究已经证实Eos特异性趋化因子eotaxin通过与Eos表面受体CCR3结合，在骨髓Eos的快速动员及Eos经局部微循环募集到炎症组织的过程发挥关键作用。但迄今为止，对抗原激发后CD34~+祖细胞由骨髓向气道迁移的机制尚未完全明了。近年的研究发现，人骨髓CD34~+祖细胞表面亦存在CCR3受体，且哮喘患者抗原激发后CD34~+祖细胞表面CCR3表达增加，提示eotaxin/CCR3径路可能在CD34~+祖细胞的迁移和分化中也扮演重要角色。糖皮质激素是当前哮喘抗炎治疗中最有效的药物。研究发现糖皮质激素可以减少Eos活化趋化因子eotaxin的产生及Eos表面受体CCR3的表达，通过调节eotaxin/CCR3径路发挥其抑制气道Eos炎症的作用。糖皮质激素是否也可以通过eotaxin/CCR3径路调节哮喘状态下CD34~+祖细胞的迁移与分化目前尚不清楚。为此，我们建立哮喘模型，通过体内、体外实验观察了eotaxin/CCR3径路与抗原激发后哮喘小鼠骨髓CD34~+祖细胞迁移与分化的关系，并研究了体内给予地塞米松对抗原激发后骨髓CD34~+祖细胞迁移和分化的影响。由于获取较高纯度的小鼠骨髓CD34~+组细胞是本研究体外实验部分的重要基础之一，因此，本研究中我们首先对分离纯化CD34~+组细胞的方法学进行了探讨。第一部分磁性活化细胞分选系统分离提纯小鼠骨髓CD34~+造血干细胞目的：探讨磁性活化细胞分选系统分离提纯骨髓CD34~+造血干细胞的可行性及其对细胞活力的影响。方法：清洁级C57BL/6小鼠，6-8周龄，体重17-20克，雌雄不拘，浙江大学医学院动物中心提供。以卵白蛋白(ovablumin，OVA)作为抗原进行两次腹腔注射致敏和三次雾化吸入激发，建立哮喘模型，同时设立空白对照组(以生理盐水代替OVA)，于最后一次抗原激发后48小时收集小鼠股骨骨髓细胞，制备单细胞悬液，通过percoll密度梯度离心获取单个核细胞层，通过塑料培养瓶培养收获非黏附单个核细胞，分别采用磁性活化细胞分选系统阳性选择、阴性选择及阴性选择结合阳性选择的分选策略分离小鼠骨髓CD34~+造血干细胞。台盼蓝染色观察细胞活力，流式细胞仪分析分选前CD34~+细胞的比例及分选后CD34~+细胞的纯度。结果：MACS阳性选择前模型组小鼠骨髓CD34~+细胞比例比对照组略高，(2.98±0.62)％vs(1.79±0.75)％，但差异无统计学意义(P＞0.05)，分选后模型组和对照组CD34~+细胞纯度分别为(61.66±10.53)％、(49.31±4.3)％，两者无显著差异(P＞0.05)。MACS阳性选择、阴性选择及阴性选择结合阳性选择三种分选策略均可不同程度富集CD34~+细胞[(54.79±5.32)％，(7.67±1.46)％，(70.09±4.02)％]，与各自分选前相比差异有显著性[(2.29±0.52)％，(1.62±0.72)％，(1.62±0.72)％，P＜0.05]。阴性选择结合阳性选择获取的细胞纯度略高于单独阳性选择，但差异无统计学意义(P＞0.05)。三种分选策略对细胞活性均无明显影响，分选后的细胞活力与分选前相比差异无显著性[(94.22±2.95)％vs(99.00±1.32)％，(96.7±+0.96)％vs(99.00±0.82)％，(93.75±1.71)％vs(99.00±0.82)％，P＞0.05]。结论：磁性活化细胞分选系统阳性选择及阴性选择结合阳性选择的分选策略均可以获得较高纯度的小鼠骨髓CD34~+造血干细胞，且对细胞活力无明显影响。第二部分Eotaxin/CCR3径路与哮喘小鼠骨髓CD34~+造血干细胞迁移与分化：CCR3mAb的作用目的：探讨Eotaxin/CCR3径路与哮喘小鼠骨髓CD34~+造血干细胞迁移与分化的关系以及CCR3mAb的作用。方法：健康雄性C57BL/6小鼠，清洁级，6-8周龄，体重18-22g。随机分为四组：生理盐水对照组(NS/NS组)、模型组(OVA/OVA组)、CCR3mAb组(OVA/CCR3mAb组)、抗体对照组(OVA/IgG组)。以卵白蛋白(OVA)致敏和激发建立哮喘模型；生理盐水对照组以同等剂量的生理盐水代替OVA：CCR3mAb组在每次抗原激发前1小时经腹腔注射CCR3mAb(5mg/kg)，余同模型组；抗体对照组以同等剂量的ns-IgG代替CCR3mAb，余同CCR3mAb组。于最后一次抗原激发后48小时检测气道反应性、支气管肺泡灌洗液、外周血和骨髓中的嗜酸粒细胞数、CD34~+祖细胞数及CD34~+祖细胞上CCR3的表达；肺组织病理切片观察嗜酸粒细胞和其它炎症细胞的浸润情况；分离纯化小鼠骨髓CD34~+祖细胞，体外趋化试验及克隆形成试验检测eotaxin在骨髓CD34~+祖细胞迁移与分化中的作用及CCR3mAb对该过程的影响。结果：抗原激发后模型组小鼠气道反应性、支气管肺泡灌洗液中Eos、CD34~+祖细胞、CD34~+/CCR3~+细胞及肺组织Eos浸润情况较生理盐水对照组明显增加(P＜0.05)。CCR3mAb组小鼠肺泡灌洗液中Eos、CD34~+细胞数及CD34~+/CCR3~+细胞数及外周血中Eos较模型组明显减少，气道Eos浸润、气道高反应性及粘液高分泌亦较模型组明显减轻(P＜0.05)。抗体对照组与模型组相比无显著差异(P＞0.05)。相关性分析表明，支气管肺泡灌洗液中的Eos数与骨髓中Eos数、CD34~+/CCR3~+细胞数及肺泡灌洗液中CD34~+细胞数呈显著正相关(p＜0.05)，与骨髓CD34~+细胞数无显著相关(p＞0.05)。体外趋化试验表明模型组小鼠骨髓CD34~+祖细胞对eotaxin趋化反应明显增强，与生理盐水组相比差异有显著性(P＜0.05)。与CCR3mAb孵育后骨髓CD34~+祖细胞对eotaxin趋化反应被明显抑制(P＜0.05)。克隆形成试验表明，单独给予eotaxin刺激不能诱导骨髓祖细胞Eos克隆形成，但在IL-5刺激的模型组小鼠骨髓祖细胞培养中加入eotaxin可以进一步增加Eos克隆形成数。骨髓CD34~+祖细胞与CCR3mAb孵育之后eotaxin在IL-5刺激的Eos克隆形成中的协同作用则完全被消除。结论：抗原激发后骨髓CD34~+祖细胞CCR3表达上调与抗原激发诱导的哮喘小鼠气道Eos炎症密切相关。eotaxin/CCR3径路参与了抗原激发后哮喘小鼠骨髓CD34~+祖细胞的迁移和分化。CCR3mAb可以明显抑制抗原激发后哮喘小鼠气道Eos炎症及骨髓CD34~+祖细胞的迁移和分化。CCR3mAb可能会成为一种有前景的治疗哮喘气道炎症的新策略。第三部分Eotaxin/CCR3径路与哮喘小鼠骨髓CD34~+造血干细胞迁移与分化：地塞米松的作用目的：探讨糖皮质激素是否可以通过eotaxin/CCR3径路调节抗原激发后CD34~+祖细胞的迁移和分化。方法：健康雄性C57BL/6小鼠，随机分为三组：生理盐水对照组(NS/NS组)、模型组(OVA/OVA组)、地塞米松组(OVA/DXM组)。以卵白蛋白(OVA)致敏和激发建立哮喘模型；生理盐水对照组以同等剂量的生理盐水代替OVA；地塞米松组在每次抗原激发前经腹腔注射地塞米松(2.5mg/kg)，余同模型组。于最后一次抗原激发后48小时测气道反应性、BALF、外周血和骨髓中的Eos数、CD34~+祖细胞数及CD34~+祖细胞CCR3的表达；肺组织病理切片观察嗜酸粒细胞浸润情况：real time PCR检测骨髓非粘附单个核细胞CCR3mRNA表达，原位杂交检测IL-5Ra mRNA表达。体外趋化试验及克隆形成试验检测体内给予地塞米松对骨髓CD34~+祖细胞迁移与分化的影响。结果：地塞米松组小鼠抗原激发后气道反应性、肺组织Eos浸润情况、BALF中Eos数、CD34~+祖细胞数和CD34~+/CCR3~+细胞数均较模型组明显减轻(P＜0.05)。体内给予地塞米松后哮喘小鼠骨髓非粘附单个核细胞CCR3及IL-5Ra mRNA表达均较模型组明显下调(P＜0.05)。体外趋化试验表明地塞米松组小鼠骨髓CD34~+祖细胞对eotaxin趋化反应与模型组相比明显减弱(P＜0.05)。克隆形成试验表明，在IL-5刺激的模型组小鼠骨髓非黏附单个核细胞培养中加入eotaxin可以进一步增加Eos克隆形成数，但在地塞米松组小鼠骨髓非黏附单个核细胞培养中观察不到这一现象。单独给予eotaxin刺激对各组小鼠均不能诱导骨髓祖细胞形成Eos克隆。结论：体内给予地塞米松可以减轻哮喘小鼠气道Eos炎症、气道高反应性和黏液高分泌。地塞米松可以抑制抗原激发后哮喘小鼠骨髓CD34~+祖细胞CCR3和IL-5Ra mRNA表达上调，部分经由调节eotaxin/CCR3径路达到抑制抗原激发后哮喘小鼠骨髓CD34~+祖细胞迁移与分化的作用。本研究中我们首先探讨了磁性活化细胞分选系统分离提纯小鼠骨髓CD34~+造血干细胞的可行性，并对不同的分选策略进行了比较。在获取较高纯度CD34~+祖细胞的基础上进一步研究了eotaxin/CCR3径路与抗原激发后哮喘小鼠骨髓CD34~+祖细胞迁移与分化的关系，得出如下结论：1．磁性活化细胞分选系统阳性选择及阴性选择结合阳性选择的分选策略均可以获得较高纯度的小鼠骨髓CD34~+造血干细胞，且对细胞活力无明显影响。2．抗原激发后骨髓CD34~+祖细胞CCR3表达上调与抗原激发诱导的哮喘小鼠气道Eos炎症密切相关。3．Eotaxin/CCR3径路参与了哮喘小鼠抗原激发后骨髓CD34~+祖细胞的迁移与分化。4．CCR3mAb可以抑制抗原激发后哮喘小鼠气道Eos炎症及骨髓CD34~+祖细胞的迁移和分化。CCR3mAb可能会成为一种有前景的治疗哮喘气道炎症的新策略。5．体内给予地塞米松可以减轻抗原激发后哮喘小鼠气道嗜酸粒细胞募集、气道高反应性和黏液高分泌状态。6．体内给予地塞米松可以抑制抗原激发后哮喘小鼠骨髓CD34~+细胞上CCR3和IL-5RαmRNA的表达上调。7．地塞米松可以部分经由调节eotaxin/CCR3径路抑制抗原激发后哮喘小鼠骨髓CD34~+造血干细胞的迁移与分化。