天麻缓解动脉粥样硬化的提取条件优化及药理作用研究

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天麻为兰科植物天麻Gastrodia elata Bl.的干燥块茎,味甘,性微温,归经属肝,具有平肝息风止痉,祛风通络等功效。常用于治疗眩晕眼黑,头风头痛,肢体麻木,半身不遂,语言蹇涩,小儿惊痫动风等症。主要含有酚类、有机酸类、多糖类、甾醇类等成分,其中天麻素为天麻的主要化学成分,而其衍生物与天麻苷元也发挥着重要的药理学活性。基于此,本研究结合了天麻的化学成分含量和体外生物活性,对天麻的提取条件进行优化,以得到最佳的提取条件方案。建立大鼠动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)模型和氧化低密度脂蛋白(Oxygenized low density lipoprotein,ox-LDL)对人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)损伤模型,从体内外的调节脂质代谢紊乱、抗氧化损伤、抗炎症损伤和保护内皮细胞损伤等多个角度,解释了天麻抗AS的作用。为深入研究天麻对AS相关血管损伤的修复机制,建立血管内皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂 Ⅱ(Vascular endothelial growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor Ⅱ,VRI)诱导的Tg(fli-1:EGFP)y1转基因斑马鱼的血管损伤模型,通过其对血管内皮损伤的保护作用,探究天麻缓解AS的作用及机制,从多角度多环节为研究中药的效应机制提供了借鉴。论文研究内容主要包括以下几个部分:一、文献研究通过查阅国内外文献,对天麻的来源分布、化学成分、药理活性、临床应用等进行探讨。对中药治疗AS的进展进行综述,包括了 AS的发病机制,以及对其具有治疗作用的中药有效成分、单味药和复方制剂的研究。二、通过响应面法结合化学成分和药效对天麻的提取工艺优化研究本研究选用高效液相色谱法(High performance liquid chromatography,HPLC)对天麻中的六种天麻素类成分进行定量分析,包括天麻素,对羟基苯甲醇,巴利森苷A,巴利森苷B,巴利森苷C,巴利森苷E。其次,选用 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)自由基清除试验测定其抗氧化活性,通过测定对HUVECs损伤修复率评价其对细胞的保护能力,结合两者作为生物活性的考察。结果表明天麻对DPPH自由基清除率的IC50值在21.23~44.65 mg/mL范围内,而对HUVECs的损伤修复率在18.13%~38.65%之间,表明天麻具有较好的抗氧化活性,且对HUVECs的氧化损伤具有保护修复作用。结合化学成分含量和生物活性评价,建立Box-Behnken设计(Box-Behnken Design,BBD)的响应面(Response surface method,RSM)模型,通过二次多项回归拟合模型确定了提取天麻的最佳条件:乙醇浓度41%,液固比28.58 mL/g,浸泡时间23.91小时,超声时间46.60分钟,建立的综合化学成分含量和生物活性指标的方法被证明具有一定的可行性。三、天麻对动脉粥样硬化模型大鼠的影响的研究AS是多种心脑血管疾病的病理基础,发病机制复杂。通过高脂饲料喂养建立大鼠模型,探究天麻通过调节脂质代谢对AS的缓解作用。将66只雄性SD大鼠随机分组,模型建立后分别用非诺贝特(0.03 g/kg/d)和不同剂量的天麻提取液(0.25、0.5、1 g/kg/d)持续灌胃4周后,采集血液样本和组织样本进行测定。试验结果表明,AS模型大鼠的肝脏指数显著上升(P<0.01),血清中总胆固醇(Total cholesterol,TC)、甘油三酯(Triglyceride,TG)、低密度脂蛋白胆固醇(Low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C)、非高密度脂蛋白胆固醇(Non-high-density lipoprotein cholesterol,non-HDL-C)的含量及动脉粥样硬化指数(Atherogenic index,AI)水平均有显著的增加(P<0.01)。血液流变学指标显示,全血低切粘度、中切粘度和高切粘度,以及血浆粘度和红细胞聚集指数都明显升高(P<0.01)。病理分析显示,主动脉有明显病理损伤,脂质浸润,出现脂质沉积和斑块。通过用不同剂量的天麻提取液进行干预,显著调节并缓解了上述病理变化,使血脂水平下降,血液黏度降低,肝脏和动脉的病理变化所有改善,可见天麻可以通过对脂质代谢的调节,改善AS病变的发生与发展。通过AS大鼠模型的建立,在灌胃给药4周后,测定大鼠血清和肝组织中的氧化应激、抗炎和血管内皮相关因子水平。试验结果表明,天麻提取物能够显著升高AS模型大鼠血清和肝组织中过氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)和谷胱甘肽(Glutathione,GSH)水平(P<0.01),显著降低丙二醛(Malonaldehyde,MDA)和乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase,LDH)水平(P<0.01)。血清中的内皮素-1(Endothelin 1,ET-1)、肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor α,TNF-α)、白细胞介素-6(Interleukin 6,IL-6)水平显著下降,而一氧化氮(Nitric oxide,NO)含量明显升高。可见,天麻提取物能缓解氧化应激损伤,同时还能保护血管内皮细胞,改善相关炎症反应,从而起到抗动脉粥样硬化的作用。综上所述,天麻能通过其抗氧化活性、抗炎活性和保护内皮损伤能力,来缓解AS的病变。四、天麻缓解动脉粥样硬化的体外抗氧化损伤及抗炎作用研究体外试验结果表明,经ox-LDL诱导损伤后,3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide,MTT)测定的HUVECs细胞活力明显下降,细胞上清液中的SOD、GSH和NO水平明显降低(P<0.01),MDA、LDH、ET-1、TNF-α 和 IL-6 水平有显著上升(P<0.05,P<0.01)。在天麻提取物干预作用后,细胞受到的氧化损伤、炎症损伤和内皮细胞损伤均有一定的修复改善作用。说明通过调节氧化还原因子、血管内皮相关因子和炎性细胞因子,内皮细胞损伤,保护损伤的HUVECs内皮细胞。由此可见,天麻在体外也能通过其抗氧化活性、抗炎活性和保护内皮损伤能力,来缓解AS的病变。五、基于斑马鱼血管损伤模型的天麻对动脉粥样硬化作用机制研究通过VRI诱导的Tg(fli-1:EGFP)y1转基因斑马鱼的血管损伤模型的建立,探究天麻通过修复内皮细胞抗AS的潜在作用机制。模型建立后,用50、100、200 μg/mL的天麻提取物干预,观察各组斑马鱼节间血管(Intersegmental blood vessels,ISVs)的生长情况,统计节间血管数,计算节间血管指数。另外,利用实时荧光定量聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)技术,检测斑马鱼中血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)信号传导的相关因子表达,包括抗体kdrl、血管内皮生长因子受体-1(Vascular endothelial growth factor receptor 1,flt-1)、血管性血友病因子(von Willebrand factor,vWF)和血管内皮生长因子 A(Vascular endothelial growth factor A,VEGF-A)。试验结果表明天麻提取物能使损伤的斑马鱼节间血管逐渐修复,节间血管指数明显上升,与模型组对比,天麻提取物的促血管新生作用明显(P<0.05,P<0.01)。实时荧光定量PCR试验结果表明,天麻可以上调促血管新生的相关基因表达kdr1、flt-1、vWF、VEGF-A。说明天麻能够通过调节VEGF信号传导的相关因子,促进损伤血管修复,而这一机制推测与其能够缓解动脉粥样硬化病变的作用相关。
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