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第一部分慢性丙型肝炎患者血清中血脂水平和mi R-122表达量的研究研究背景丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)感染是全球重大的公共卫生问题。据世界卫生组织统计,全球HCV的感染率约为3%,大约70%的HCV感染者为慢性感染。据报道,在慢性丙型肝炎(chronic hepatitis C,CHC)患者中,约40%~86%的HCV感染者合并脂肪肝,尤其是在基因型为3型的HCV感染者中,合并脂肪肝的比率高达75%。与单纯的CHC患者相比,合并脂肪肝的CHC患者往往具有更低的持续病毒应答(sustained virological response,SVR),因而成为临床上的难治性丙型肝炎患者,更容易进展成终末期肝病甚至是肝癌。近几年针对HCV感染研发的直接抗病毒药物(directly acting antivirals,DAAs)在HCV治疗上取得了里程碑式的进展,但是由于HCV感染的隐匿性,部分CHC患者在接受抗病毒治疗时已经是中晚期,与CHC相关的一些肝脏病理改变以及代谢综合征等肝外症状仍然难以逆转。因此,HCV与宿主间的相互作用,以及HCV介导的肝脏疾病的发病机制的相关研究仍是临床研究的重点。微小核糖核酸(micro-ribose nucleic acid,mi RNA)是一类内源性的非编码小分子RNA,主要在转录后水平调控基因表达,参与细胞的多种生物学过程。mi R-122是肝脏特异性且含量最多的mi RNA,占肝脏总mi RNA的70%。有研究表明mi R-122可以调节脂质代谢,并且与病毒复制有关。但是目前mi R-122在HCV感染的背景下与脂质代谢的关系报道较少,对于HCV感染引发的肝脂代谢紊乱以及如何进展成肝癌的机制尚不清楚。课题过探讨mi R-122在HCV感染导致的脂代谢紊乱中的作用,有助于了解宿主因素和病毒间的相互作用,为慢性HCV感染导致的脂肪肝机制研究提供思路。研究目的1研究CHC患者和健康人血清血脂水平的差异。2研究CHC患者和健康人血清mi R-122表达量的差异,并分析CHC患者血清mi R-122表达量与血脂水平的关系。研究方法1研究对象:收集2017年7月至2018年10月武汉大学人民医院收治的初入院的CHC患者作为实验组,CHC诊断标准符合《丙型肝炎防治指南(2015年更新版)》,排除HIV感染或其他嗜肝性病毒感染,其他系统重大疾病,服用降脂药物或其他肝功能损害的药物,酒精性脂肪肝患者和自身免疫性疾病等。选择同期性别年龄匹配的健康体检者作为正常对照组,健康体检者均未合并HCV及其他嗜肝性病毒感染,且肝肾功能和血脂水平正常。2血清血脂水平的检测:采用全自动生化分析仪检测实验组和对照组的血清甘油三酯(triglyceride,TG)、总胆固醇(total cholesterol,TCH)、高密度脂蛋白(high-density lipoproteincholesterol,HDL-C)、低密度脂蛋白(low-density lipoproteincholesterol,LDL-C)、小而低密度脂蛋白(small and low-density lipoprotein,sd LDL)、脂蛋白a[lipoprotein a,L(a)]、载脂蛋白A1(apolipoprotein A1,Apo A1)和载脂蛋白B(apolipoprotein B,Apo B)水平。3血清mi R-122表达量的检测:根据mi RNA数据库(the micro RNA database,mi RBase)上提供的hsa-mi R-122-5p(MIMAT0000421)和外参cel-mi R-39-3p(MIMAT0000010)序列合成茎环引物和PCR引物,并在BLAST上进行引物验证,采用实时荧光定量PCR检测mi R-122和cel-mi R-39的表达水平。4统计分析:利用SPSS 24.0软件进行统计分析。单样本Kolmogorov-Smirnov(K-S)检验各组数据正态性,正态分布的计量资料以均数±标准差(x±s)表示,两组间比较采用t检验,多组均数间比较采用方差分析,多组均数间的两两比较采用SNK法,相关分析采用pearson法;非正态分布的计量资料以中位数和四分位数间距M(P25,P75)表示,组间比较采用Mann-Whitney U检验,相关分析采用spearman法;计数资料以百分数表示,组间比较采用卡方检验。利用Graphpad Prism软件进行绘图,以P<0.05为差异有统计学意义。研究结果1与正常对照组相比,CHC组的肝功能指标(ALT、AST、TBIL、DBIL、GGT、PA、TP和ALB)明显异常,差异有统计学意义(P<0.05);凝血指标(PT、PT-act、PT-INR、APTT、TT、FIB和D-Dimer)存在差异,差异有统计学意义(P<0.05)。2 CHC患者的血清TCH、HDL-C、LDL-C、sd LDL、Apo A1和Apo B水平明显低于健康对照组,差异有统计学意义(P<0.05);两组的血清TG和L(a)水平差异无统计学意义(P>0.05)。3 CHC患者血清mi R-122表达量明显高于健康对照组,差异有统计学意义(t=-4.578,P<0.05)。4 CHC患者血清mi R-122表达量与肝功能指标ALT和AST呈正相关性(r=0.497和0.489,P均<0.05)。5 CHC患者血清mi R-122的相对表达量与血脂指标TCH、LDL-C、sd LDL和Apo B水平呈弱负相关性(r=-0.287,-0.329,-0.270和-0.290,P均<0.05),与TG、HDL-C、L(a)和Apo A1水平的相关性无统计学意义(r=-0.058,-0.098,-0.085和-0.174,P均>0.05)。研究结论1 CHC患者血清血脂水平明显下调,血清mi R-122水平明显上调,且血清mi R-122水平与血脂TCH、LDL-C、sd LDL和Apo B水平具有负相关性。2 CHC患者血脂紊乱可能与mi R-122有关。第二部分JFH-1病毒对Huh7.5.1细胞中mi R-122水平和脂质合成相关信号通路的影响研究背景本课题前期研究表明,CHC患者与健康对照组相比,血清血脂水平下调,而mi R-122表达上调,并且两者具有一定相关性。为了进一步确定HCV感染对肝细胞内mi R-122水平和脂质合成相关信号通路的影响,我们利用JFH-1病毒株感染Huh7.5.1细胞模型,在体外水平上进一步探讨HCV感染后肝细胞内mi R-122水平,脂肪酸合成通路SREBF1/FASN/ACACA和胆固醇合成通路SREBF2/HMGR的变化,更好的了解HCV对宿主因素的影响。研究目的探讨JFH-1病毒株对Huh7.5.1细胞mi R-122水平和脂质合成相关信号通路的影响。研究方法1 Huh7.5.1细胞的培养。2 JFH-1病毒株的扩增和浓缩:在对数生长期的Huh7.5.1细胞上,直接接种含有HCVcc(JFH-1)病毒的培养液上清,培养3-5d,留取上清,超速离心并过滤,获得浓缩病毒。3 JFH-1病毒感染Huh7.5.1细胞:在对数生长期的Huh7.5.1细胞上,直接接种含有HCVcc(JFH-1)病毒的培养液上清,从加入病毒后开始计时,分别收取JFH-1感染后0h,24h,48h,72h和96h的Huh7.5.1细胞。Tziol法提取细胞总RNA,进行后续检测。4细胞mi R-122表达量检测:根据mi RNA数据库上提供的hsa-mi R-122-5p序列合成茎环引物和PCR引物,并在BLAST上进行引物验证,采用实时荧光定量PCR检测mi R-122的表达水平。5脂代谢合成相关信号通路的基因表达量检测:根据NCBI上目的基因的m RNA序列设计PCR引物,并在BLAST上进行引物验证,采用实时荧光定量PCR检测SREBF1、FASN、ACACA、SREBF2、HMGR和GAPDH m RNA的表达水平。6统计学分析:利用SPSS 24.0软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差(x±s)或中位数和四分位数间距M(P25,P75)表示,两组间的均数比较采用t检验,多组间的均数比较采用方差分析。利用Graphpad Prism软件进行绘图,以P<0.05为差异有统计学意义。研究结果1 Huh7.5.1细胞感染JFH-1病毒颗粒后24h和48h,SREBF1、FASN、ACACA、SREBF2和HMGR基因m RNA表达量与空白对照相比,差异均无统计学意义(P均>0.05);Huh7.5.1细胞感染JFH-1病毒颗粒后72h和96h,SREBF1基因m RNA表达量分别为空白对照组的166.725倍和542.045倍,差异有统计学意义(t=-4.138和-4.891,P=0.014和0.008);FASN基因m RNA表达量分别为空白对照组的68.114倍和205.855倍,差异有统计学意义(t=-4.842和-8.640,P=0.008和0.001);ACACA基因m RNA表达量分别为空白对照组的7.561倍和28.077倍,差异有统计学意义(t=-3.572和-3.775,P=0.023和0.020);SREBF2基因m RNA表达量分别为空白对照组的194.925倍和493.408倍,差异有统计学意义(t=-3.994和-4.030,P=0.016和0.016);HMGR基因m RNA表达量分别为空白对照组的4.702倍和9.816倍,差异有统计学意义(t=-7.716和-10.273,P=0.002和0.001)。2与空白对照相比,实验组中Huh7.5.1细胞感染JFH-1病毒24h后,mi R-122的相对表达量分别是空白对照组的0.901倍,差异无统计学意义(P>0.05),实验组中Huh7.5.1细胞感染JFH-1病毒48h、72h和96h后,mi R-122的相对表达量分别是空白对照组的0.602倍、0.413倍和0.365倍,差异有统计学意义(t=8.120,12.736和14.034,P=0.001,0.000和0.000)。研究结论1 JFH-1病毒颗粒感染Huh7.5.1细胞后,脂肪酸和胆固醇合成的相关基因表达量上调。2 JFH-1病毒颗粒感染Huh7.5.1细胞后,mi R-122的表达量下调。第三部分mi R-122在JFH-1病毒感染导致的肝细胞脂代谢紊乱的作用机制研究研究背景本课题前期研究发现,JFH-1病毒感染后可能会激活肝细胞内脂代谢合成通路,同时也观察到mi R-122表达量降低。为了探讨JFH-1病毒感染是否通过mi R-122的作用激活肝细胞内的脂代谢合成通路,我们利用人工合成的mi R-122模拟物(mi R-122 mimics)和mi R-122抑制剂(mi R-122 inhibitor)分别过表达和抑制mi R-122后,探讨JFH-1病毒感染对肝细胞脂质代谢的影响。研究目的探讨mi R-122在JFH-1病毒感染导致的肝细胞脂代谢紊乱的作用机制。研究方法1 Huh7.5.1细胞的培养。2 JFH-1病毒株的扩增和浓缩:在对数生长期的Huh7.5.1细胞上,直接接种含有HCVcc(JFH-1)病毒的培养液上清,培养3-5d,留取上清,超速离心并过滤,获得浓缩病毒。3 mi R-122 mimics转染:待对数生长期的Huh7.5.1细胞融合度长到约40%-50%时,按照空白对照(Mock)、JFH-1感染(HCV)、mi R-122模拟物+JFH-1感染(mimics+HCV)、mi R-122模拟物(mimics)、mimics双链阴性对照+JFH-1感染(mimics NC+HCV)和mimics双链阴性对照(mimics NC)分别转染Huh7.5.1细胞。从加入转染试剂后开始计时,6h后接种含有JFH-1病毒的培养液上清,72h收取细胞并提取总RNA,进行后续检测。4 mi R-122 inhibitor转染:待对数生长期的Huh7.5.1细胞密度长到约40%-50%时,按照空白对照(Mock)、JFH-1感染(HCV)、mi R-122抑制剂+JFH-1感染(inhibitor+HCV)、mi R-122抑制剂(inhibitor)、inhibitor单链阴性对照+JFH-1感染(inhibitor NC+HCV)和inhibitor单链阴性对照(inhibitor NC)分别转染Huh7.5.1细胞。从加入转染试剂后开始计时,6h后接种含有HCVcc(JFH-1)病毒的培养液上清,72h收取细胞并提取总RNA,进行后续检测。5细胞mi R-122表达量检测:根据mi RNA数据库上提供的hsa-mi R-122-5p序列合成茎环引物和PCR引物,并在BLAST上进行引物验证,采用实时荧光定量PCR检测mi R-122的表达水平。6脂代谢合成相关信号通路的基因表达量检测:根据NCBI上目的基因的m RNA序列设计PCR引物,并在BLAST上进行引物验证,采用实时荧光定量PCR检测SREBF1、FASN、ACACA、SREBF2、HMGR和GAPDH m RNA的表达水平。7统计学分析:利用SPSS 24.0软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差(x±s)或中位数和四分位数间距M(P25,P75)表示,两组间的均数比较采用t检验,多组间的均数比较采用方差分析。利用Graphpad Prism软件进行绘图,以P<0.05为差异有统计学意义。研究结果1与转染mimics NC(对照组)的Huh7.5.1细胞相比,转染mimics(实验组)的Huh7.5.1细胞内mi R-122的表达量显著升高,差异有统计学意义(P<0.05)。2与转染inhibitor NC(对照组)的Huh7.5.1细胞相比,转染inhibitor(实验组)的Huh7.5.1细胞内mi R-122的表达量显著降低,差异有统计学意义(P<0.05)。3与空白对照组(Mock)相比,HCV组细胞mi R-122及脂代谢相关基因SREBF1、FASN、ACACA、SREBF2和HMGR的m RNA表达量分别是Mock组的0.509倍、2.386倍、1.847倍、1.397倍、2.064倍和1.392倍,差异均有统计学意义(P<0.05)。4与mimics NC组相比,mimics组细胞脂代谢相关基因SREBF1、FASN、ACACA、SREBF2和HMGR的m RNA表达量均显著下调,分别为对照组的0.072倍、0.069倍、0.175倍、0.038倍和0.123倍,差异均有统计学意义(P<0.05)。5与mimics NC+HCV组相比,mimics+HCV组细胞脂代谢相关基因SREBF1、FASN、ACACA、SREBF2和HMGR的m RNA表达量分别是对照组的0.344倍、0.127倍、0.327倍、0.303倍和0.428倍,差异有统计学意义(P<0.05)。6与inhibior NC组相比,inhibitor组细胞脂代谢相关基因SREBF1、FASN和HMGR的m RNA表达量均上调,分别为对照组的1.344倍、1.737倍和1.318倍,差异有统计学意义(P<0.05),脂代谢相关基因ACACA和SREBF2与转染inhibior NC细胞相比,差异无统计学意义(P>0.05)。7与inhibitor NC+HCV组相比,inhibitor+HCV组细胞脂代谢相关基因SREBF1、FASN、ACACA、SREBF2表达量差异均无统计学意义(P>0.05),脂代谢相关基因HMGR是对照组的1.178倍,差异有统计学意义(P<0.05)。研究结论1 mi R-122可以降低脂代谢合成相关基因SREBF1、FASN、ACACA、SREBF2和HMGR的表达量。2体外转染mi R-122mimics可以缓解HCV感染导致的肝细胞内脂质合成增加。3 mi R-122可能与HCV感染导致的肝细胞内脂质合成增加有关。