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目的:研究十全大补汤总多糖的免疫抑瘤作用。通过动物实验观察不同剂量十全大补汤总多糖成分对荷瘤小鼠体内肿瘤的生长、脾脏T细胞和B细胞的增殖及其产生IL-2、IFN等细胞因子水平的影响;同时以敏感化疗药物作为对照,观察其总多糖成分与化疗药物是否具有协同抑瘤作用及免疫增强作用;观察十全大补汤总多糖成分在体外的抑瘤及免疫调节作用。
方法:本研究包括体外实验和体内实验两部分。
体外实验:体外培养人肺癌细胞A549、人结肠癌细胞HT-8和人肝癌细胞Bel-7402。用含10%小牛血清的RPMI-1640培养基调细胞数为2×104/ml,同时无菌操作取正常小鼠脾细胞,用含10%牛血清的RPMI-1640培养基调细胞数为2×106/ml,分别接种于96孔培养板(90μl/孔)。用MTT方法检测不同浓度十全大补汤总多糖(200ug/ml,100ug/ml,50ug/ml,25ug/ml,12.5ug/ml)对肿瘤细胞及正常脾细胞增殖的影响。
体内实验:昆明种小鼠50只,每只左侧腋窝皮下接种H22肝癌细胞(5×106/ml)0.2ml。接种肿瘤细胞后随机分为5组,每组10只:1组为荷瘤对照组,2组为化疗组,3组为高剂量多糖加化疗组,4组为中剂量多糖加化疗组,5组为低剂量多糖加化疗组。各组小鼠于接种肿瘤后24小时开始给药:1组每只腹腔注射生理盐水0.2ml,0.5ml白开水灌胃;2组每只腹腔注射顺铂(2mg/kg),0.5ml白开水灌胃;3、4、5组小鼠在每只腹腔注射顺铂(2mg/kg)的同时分别给予0.5ml浓度为168mg/ml、84mg/ml及42mg/ml的多糖灌胃,连续给药10天。于停药后24小时,将小鼠处死,剥离瘤块称重,计算肿瘤抑制率;取脾脏称重,计算脾脏指数;分离脾细胞,用MTT法检测脾脏T淋巴细胞、B淋巴细胞的增殖活性,ELISA方法检测脾细胞培养上清液中IFN-γ和IL-2的水平;全自动血细胞分析仪检测小鼠外周血白细胞(WBC)、红细胞(RBC)及血红蛋白(HGB)的变化。
实验结果:
1、体外实验结果:
1.1十全大补汤总多糖对人肺癌细胞A549的抑制作用
各剂量多糖组在培养24h和48h后对人肺癌细胞A549都有明显的抑制作用,在培养后24h,200ug/ml和100ug/ml多糖组的OD值明显低于对照组(P<0.01);在培养后48h,50ug/ml、25ug/ml和12.5 ug/ml多糖组的OD值明显低于对照组(P<0.01);在培养后72h,200ug/ml、100ug/ml及50ug/ml的多糖对A549有明显抑制作用(P<0.05),而25 ug/ml、12.5ug/ml的多糖对A549无明显抑制作用。
1.2十全大补汤总多糖对人肝癌细胞Bel-7402的抑制作用
各剂量多糖组在培养12h后对人肝癌细胞Bel-7402均无抑制作用。在培养48h后,200ug/ml、100ug/ml和50 ug/ml多糖组的OD值均明显低于对照组(P<0.05),其它剂量多糖组的OD值与对照组比较无显著性差异;在培养72h后,各剂量多糖组的OD值均明显低于对照组(P<0.05),除外12.5ug/ml组其余抑制作用尤为明显(P<0.01)。
1.3十全大补汤总多糖对人结肠癌细胞HT-8的抑制作用
各剂量多糖组在培养24h后,对人结肠癌细胞HT-8均无抑制作用。在培养48 h后,200ug/ml、100ug/ml和25ug/ml多糖组的OD值均明显低于对照组(P<0.05),其它剂量多糖组的OD值与对照组比较无显著性差异;在培养72h后,200ug/ml、100ug/ml、50ug/ml多糖组的OD值均明显低于对照组(P<0.05),其它剂量组的OD值与对照组比较无显著性差异;50ug/ml组抑制作用尤为明显(P<0.01)。
1.4十全大补汤总多糖对正常小鼠脾细胞增殖的刺激作用
各剂量多糖组在培养24h后对脾细胞的增殖均无刺激作用。在培养48 h后,100ug/ml和50ug/ml多糖组的OD值明显高于对照组(P<0.05),其它剂量多糖组的OD值与对照组比较无显著性差异;在培养72h后,200ug/ml,100ug/ml,50ug/ml和25ug/ml多糖组的OD值均明显高于对照组(P<0.05),说明在培养72h后多糖在体外可刺激脾细胞的增殖,且以100ug/ml,50ug/ml多糖组的效果最好。
2、体内实验结果:
2.1十全大补汤总多糖对荷瘤小鼠体重生长作用
顺铂可使荷瘤小鼠的体重增长受到抑制,各剂量的多糖对荷瘤小鼠的体重增长没有明显的改善作用。
2.2十全大补汤总多糖对荷瘤小鼠肿瘤生长的抑制作用
对照组、顺铂组、高剂量多糖加顺铂组、中剂量多糖加顺铂组和低剂量多糖加顺铂组肿瘤重量分别为:(1.35±0.33)克、(1.05±0.21)克、(0.87±0.28)克、(0.85±0.25)克和(1.05±0.27)克。各组小鼠的肿瘤与对照组小鼠的肿瘤比较,肿瘤重量明显降低(P<0.05)。高、中剂量多糖与顺铂联合应用组荷瘤小鼠的肿瘤重量较顺铂组小鼠的肿瘤显著降低(P<0.05),而低剂量多糖与顺铂联合应用组的肿瘤重量与顺铂组比较无显著差异。
2.3十全大补汤总多糖对荷瘤小鼠脾指数的影响
顺铂可使荷瘤小鼠的脾指数下降,与对照组比较有显著性差异(P<0.01),顺铂与高、中剂量十全大补汤总多糖联合应用组荷瘤小鼠的脾指数明显高于顺铂组(P<0.05),但仍低于肿瘤对照组而低剂量十全大补汤总多糖组的脾指数与顺铂对照组比较无显著性差异。
2.4十全大补汤总多糖对荷瘤小鼠外周血WBC、RBC和HBG的影响
顺铂组荷瘤小鼠的白细胞较荷瘤对照组显著下降(P<0.05),而高剂量多糖与顺铂联合应用使小鼠的白细胞明显提高,与顺铂组比较有显著性差异(P<0.05),中、低剂量多糖加顺铂组小鼠的白细胞也较顺铂组明显提高(P<0.05)。说明十全大补汤总多糖能减轻顺铂对白细胞的损伤作用。红细胞和血红蛋白在顺铂组与对照组之间无显著性差异,但中剂量十全大补汤总多糖组血红蛋白和红细胞数较顺铂对照组有显著提高(P<0.05)。
2.5十全大补汤总多糖对荷瘤小鼠脾脏T细胞增殖的影响
顺铂可使荷瘤小鼠脾脏T淋巴细胞刺激指数降低,与肿瘤对照组比较P<0.05,顺铂与高、中剂量多糖组T细胞刺激指数显著高于顺铂组和肿瘤对照组(P<0.01),顺铂与低剂量多糖组的T细胞刺激指数也分别高于肿瘤对照组和顺铂对照组(P<0.05),结果说明,十全大补汤总多糖可拮抗顺铂的免疫抑制作用,提高荷瘤小鼠脾脏T淋巴细胞的增殖能力,提高荷瘤机体的细胞免疫功能。
2.6十全大补汤总多糖对荷瘤小鼠脾脏B细胞增殖的影响
顺铂可使荷瘤小鼠脾脏B淋巴细胞刺激指数降低,与肿瘤对照组比较P<0.05,顺铂与高剂量多糖组B细胞刺激指数显著高于顺铂组(P<0.01),且高于肿瘤对照组(P<0.01),顺铂与中剂量多糖组的B细胞刺激指数也分别高于肿瘤对照组和顺铂对照组(P<0.05),结果说明,十全大补汤总多糖可拮抗顺铂的免疫抑制作用,提高荷瘤小鼠脾脏B淋巴细胞的增殖能力,提高荷瘤机体的体液免疫功能。
2.7十全大补汤总多糖对荷瘤小鼠脾细胞IFN-γ分泌的影响
顺铂组荷瘤小鼠的IFN-γ与荷瘤对照组比较无明显变化,各剂量组多糖与顺铂联合应用使荷瘤小鼠的IFN-γ明显升高,与顺铂组比较也明显升高,多糖剂量越高,IFN-γ的含量升高越明显。
2.8十全大补汤总多糖对荷瘤小鼠脾细胞分泌IL-2的影响
顺铂组荷瘤小鼠的IL-2水平较荷瘤对照组无明显变化,各剂量组多糖与顺铂联合应用使荷瘤小鼠的IL-2明显升高。以中、低剂量多糖组的作用效果较好。
结论:
1.十全大补汤总多糖在体外对肿瘤有抑制作用,作用效果与其剂量、瘤株类型、作用时间有关。
2.十全大补汤总多糖在体外可刺激小鼠脾细胞的增殖,具有免疫调节作用。
3.十全大补汤总多糖可以拮抗顺铂对荷瘤机体的免疫抑制作用,提高荷瘤机体的体液免疫和细胞免疫功能。
4.十全大补汤总多糖对顺铂的抑瘤功能有协同增效作用。