亚硝酸盐降解菌AQ-3的分离鉴定及安全性研究

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近年来,随着我国集约化水产养殖的快速发展,池塘老化、放养密度过高、投饲残饵过多等诸多因素普遍引起养殖水体中亚硝酸盐超标,屡屡发生水产养殖动物中毒死亡事件。物理法、化学法等常用的亚硝酸盐降解办法存在很大的局限性,效果也不理想,生物法以其更有效、价格更低廉等优点深受广大养殖户的青睐,因此,筛选具有良好降解效果、在养殖水体稳定安全的亚硝酸盐降解菌,对水产养殖业的发展是十分必要的,并且具有广泛的应用前景。虽然亚硝酸盐降解菌得到广大学者的关注,对其研究也变得逐步深入和广泛,但实际养殖中,亚硝酸盐中毒引起死亡事故仍然时有发生,亚硝酸盐氮超标问题仍未得到根本解决。我国对亚硝酸盐降解菌的研究起步相对较晚,研究基础也相对薄弱,许多问题尚未弄清楚,相关研究中存在很多问题。尤其是菌株的安全性未得到重视,养殖水体中大量投入外来菌株,存在很多安全隐患,可能会对水产养殖动物甚至对人类造成威胁,益生菌的安全性值得重视。本论文针对亚硝酸盐降解菌优良菌种匮乏,从养殖水体中分离、筛选到一株降解特性优良的菌株,并对其对水产养殖动物和水体环境的安全性进行了初级评价。现分别报道如下:实验从养殖污泥中分离筛选了一株优良的亚硝酸盐去除菌AQ3,其对亚硝酸盐的去除率高达99.47%。通过API ID32GN细菌鉴定系统以及16S rDNA序列分析法,菌株AQ3被鉴定为鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)(GenBank登录号:JF751054.1),其16S rDNA序列与基因库中不动杆菌属菌株的16S rDNA序列有99%100%的同源性,而且与不动杆菌TW (GenBank登录号:FJ753401.1)的亲缘关系最近。菌株AQ3去除亚硝酸盐的最适初始pH范围为79,最佳碳源为乙酸钠和丁二酸钠,而且随着初始菌浓度的不断增大,菌株AQ3对亚硝酸盐的去除率显著升高;随着亚硝酸盐氮浓度的不断增大,菌株AQ3对亚硝酸盐的去除率逐渐降低。实验对分离的亚硝酸盐降解菌AQ-3的致病性和耐药性进行了分析。对分离菌株AQ-3进行了aerA、hlyA、ahpA、alt、ast五种重要致病基因的检测,结果显示,菌株AQ-3不具有这五种致病基因,为了进一步验证其致病性和感染性,我们对小白鼠和鲫鱼分别进行了口灌,分析其血液指标的变化,进行毒性实验观察,血液指标正常,未发现死亡或其他发病等不正常症状,因此,我们初步认定菌株AQ-3不具有致病性和感染性。同时,对菌株AQ-3进行耐药性检测,结果显示菌株AQ-3对水产常用抗菌药均极度敏感,进一步为其安全性提供佐证。实验评价了分离的亚硝酸盐降解菌AQ-3的环境安全性。方法参照《GB/T21805-2008化学品藻类生长抑制试验》、《GB/T13266-91水质物质对蚤类(大型蚤)急性毒性测定方法》、《GB/T13267-91水质物质对淡水鱼(斑马鱼)急性毒性测定方法》、《渔药临床试验技术规范》等国家标准及相关法规,观察了亚硝酸盐降解菌AQ-3对小球藻生长抑制作用以及对大型蚤、斑马鱼的急性毒性,分析了其对养殖水体主要理化因子的影响。结果显示,亚硝酸盐降解菌AQ-3在终浓度为0.2μL/L~2000μL/L时对小球藻生长具有促进作用,对小球藻的半数抑制浓度大于2000μL/L,而且其对大型蚤、斑马鱼的半数致死浓度也大于2000μL/L。此外,在养殖水体中加入亚硝酸盐降解菌AQ-3至终浓度为0.2μL/L~2000μL/L后14天内,各浓度组的亚硝酸盐氮浓度、氨氮含量、硫化物和pH值均缓慢下降,对养殖水质有明显的改良效果。
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